学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

慢病毒eIF4E-shRNA的构建及其感染Hela细胞株的初步研究

作　者: 鲁强
导　师: 赵淑萍
学　校: 青岛大学
专　业: 妇产科学
关键词: eIF4E pLVTHM RNA干扰 Hela细胞
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 38次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的利用RNA干扰技术,以人eIF4E基因为靶基因设计特异性的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA),构建人eIF4E基因短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)重组慢病毒质粒表达载体,并进行PCR和测序鉴定；利用重组成功的慢病毒表达载体转染包装细胞293T,初步观察慢病毒颗粒对宫颈癌Hela细胞的感染情况,为进一步研究该载体对目的基因eIF4E的沉默效果以及探索宫颈癌基因治疗的新方法奠定基础。方法设计并合成人eIF4E基因特异性干扰片段,连接到经双酶切线性化的PLVTHM载体质粒,转化大肠杆菌(escherichia coli,E.coli) TOP10感受态细胞,筛选阳性菌落,扩增后提取质粒,进行PCR和测序鉴定；将成功插入干扰片段的慢病毒质粒PLVTHM、包装质粒pMDLg-pRRE、pRSV-REV、包膜质粒PMD2G按照一定比例混合,与转染试剂LipoD293TM DNA In Vitro共同转染包装细胞293T,收集含有慢病毒颗粒的培养基上清液,浓缩病毒颗粒并测定滴度,将慢病毒颗粒感染Hela细胞,初步观察Hela细胞感染情况。结果经过PCR鉴定和测序分析,成功构建出4个人eIF4E基因shRNA重组慢病毒表达载体；慢病毒质粒转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒,收集浓缩后病毒滴度达4×108TU/ml;感染Hela细胞后,初步观察发现强弱不等的荧光信号。结论成功构建了4个人eIF4e基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,并包装出慢病毒颗粒,成功感染了宫颈癌Hela细胞,为进一步研究宫颈癌靶向基因治疗奠定基础。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-6
引言  6-8
第一章实验材料  8-11
  1.1 主要材料  8-9
  1.2 主要仪器  9
  1.3 主要试剂  9-11
第二章实验方法  11-25
  2.1 慢病毒eIF4E-shRNA构建  11-20
    2.1.1 eIF4E靶点序列设计  11-14
    2.1.2 合成的寡核苷酸模板退火  14-15
    2.1.3 慢病毒质粒扩增和回收  15-16
    2.1.4 慢病毒质粒pLVTHM经双酶切后回收  16-18
    2.1.5 连接反应  18
    2.1.6 感受态细胞制备和转化  18-19
    2.1.7 重组质粒的鉴定试验  19-20
  2.2 慢病毒eIF4E-shRNA生产、浓缩与滴定  20-24
    2.2.1 293T细胞培养  20-21
    2.2.2 Hela细胞株的常规培养  21-22
    2.2.3 慢病毒的包装制备  22-24
    2.2.4 慢病毒的滴度测定  24
  2.3 慢病毒颗粒颗粒感染Hela细胞  24-25
第三章实验结果  25-30
  3.1 慢病毒eIF4E-shRNA构建  25-28
    3.1.1 慢病毒质粒pLVTHM的线性化  25
    3.1.2 重组质粒PCR鉴定  25-26
    3.1.3 重组质粒测序鉴定  26-28
  3.2 eIF4E-shRNA慢病毒包装及滴度测定  28
    3.2.1 eIF4E-shRNA慢病毒包装  28
    3.2.2 浓缩病毒的滴度测定  28
  3.3 慢病毒eIF4E-shRNA感染Hela细胞的初步观察  28-30
第四章讨论  30-33
结论  33-34
参考文献  34-37
综述  37-45
  综述的参考文献  42-45
攻读学位期间的研究成果  45-46
致谢  46-47

慢病毒eIF4E-shRNA的构建及其感染Hela细胞株的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文