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PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型的建立及初步研究

作　者: 姚娟
导　师: 丁彦青；李建明
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: PRL-3 CDH22 RNA干扰慢病毒 Wnt/β-catenin 结直肠癌
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景和目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。转移是影响患者治疗效果和导致患者死亡的主要原因,也是结直肠癌术后复发的直接原因。肿瘤的发生、发展是多种基因突变累积以及相互作用形成的基因网络调控的结果,而这些突变基因的差异表达是决定肿瘤恶性表型多样性的分子基础对这些基因进行功能研究是了解肿瘤发生发展过程的重要策略,这不仅可以探究造成基因表型差异的遗传原因或外界原因,而且对肿瘤的诊断及治疗具有非常重要的意义。因此,筛查结直肠癌转移特异性基因,探讨与结直肠癌转移相关的因素,系统阐述转移分子机制,将为结直肠癌的转移治疗提供理想的靶点。促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3),属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族成员,现被认为是结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一。随着对PRL-3研究的不断深入,它与多种肿瘤发生、转移之间的关系将逐步得到证实。但迄今为止,PRL-3的底物、其促进结直肠癌发生发展的机制以及它所参与的信号途径仍未明确。前期我们课题组应用酵母双杂交技术发现PRL-3新型相互作用蛋白质CDH22,并应用GST-pull down、免疫共沉淀及共定位技术进行了证实。CDH22(又称为PB-cadherin)与E-钙粘附蛋白同属于钙粘附蛋白家族经典型亚类成员。在结构上具有5个胞外结构域结构,除跨膜区外还具有胞内区,在钙粘附蛋白相关的信号通路中起着重要作用。目前研究发现,钙粘附蛋白家族中有许多成员都与肿瘤的发生发展关系密切。我们课题组前期实验结果显示PRL-3通过诱导E-cadherin及CDH22表达下调、促进snail表达增加参与结直肠癌细胞上皮间叶转化的形成;结果表明,PRL-3促进细胞核内β-Catenin的聚集是激活Wnt通路的的重要途径。然而具体的分子生物学机制仍需进一步探讨。既然PRL-3蛋白与CDH22存在直接的相互作用,那么二者可能共同参与某一信号转导通路或某一疾病发病过程。近年来研究发现β-catenin及其通路相关基因的改变在结直肠肿瘤发生、发展过程中具有重要作用。β-catenin蛋白分子量约为92kD～95kD,其作用涉及两个相对独立的过程,既是细胞间黏附连接的主要结构成分,参与构成E-cadherin/β-catenin复合体,维持正常上皮的极性和完整性;又是Wnt信号通路的中枢成分。在正常成熟细胞胞浆内的β-catenin大部分与细胞膜上E-cadherin胞内肽段结合,参与细胞粘连、生长、增殖等过程;少部分与胞浆内APC、GSK-3β及Axin蛋白结合成多蛋白复合体,通过磷酸化与去磷酸化过程来降解β-catenin。因而胞浆内游离β-catenin水平极低,不能进入细胞核调控相应基因表达。Wnt信号通路是一条十分保守的信号传导通路,在胚胎的发育过程及多种肿瘤的发生发展中起作用。Wnt通路发生异常的关键是胞浆内游离的β-catenin积累,与Tcf-4结合形成复合物进入核内,激活下游靶基因(如c-myc、cyclinD1、gastrin等)转录,从而启动肿瘤生长程序。β-catenin介导的β-catenin/E-cadherin复合体功能异常以及Wnt信号传导通路异常激活以及均与结直肠癌的发生、发展关系密切。在β-catenin通路相关基因中,处于上游的E-cadherin及处于核心地位的β-catenin正常表达定位于上皮细胞膜,结直肠腺瘤、结直肠腺瘤恶变和结直肠癌组织E-cadherin、β-catenin胞膜表达不同程度缺失,β-catenin呈胞浆(胞核)异位表达。下游通路中的靶基因cyclinD1是调节细胞进入细胞周期中增殖期的主要因子,其过度表达和异常调控均可导致细胞周期发生异常,从而导致肿瘤的发生。正常结直肠黏膜cyclinD1表达均为阴性,结直肠癌组织中cyclinD1主要呈细胞核表达,少数肿瘤细胞呈细胞质表达。探讨β-catenin通路相关基因在结直肠癌形成过程中的变化规律,将有助于研究肿瘤恶性表型多样性的分子机制。同时也应认识到,人体是一个由多条信号转导途径交织成网络、共同作用的有机整体,在研究β-catenin/Wnt途径的同时,研究其他途径的作用以及β-catenin/Wnt通路与其他因素之间的相互影响,将为肿瘤侵袭转移的分子机制提供一个新的解释。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的出现为基因功能研究提供了一种新的、高效和特异的功能基因组研究策略,已经应用于功能基因组学、药物靶点筛选和细胞信号传导通路分析等方面。本研究采用RNAi技术建立PRL-3和CDH-22双基因表达下调的结直肠癌细胞模型,然后对其生物学特性的改变进行了初步的研究,通过比较其与同一亲本来源的对照组细胞的形态、生物学特性、基因表达、蛋白差异等,探讨PRL-3、CDH22与β-catenin/Wnt信号通路相关基因的相互作用,本研究有助于更深入了解肿瘤侵袭转移的分子机制。方法1.靶向人CDH22基因RNAi慢病毒的包装、滴度测定2.慢病毒对SW480/PRL-3-细胞的二次感染将5×10~4个SW480/PRL-3-细胞接种于24孔板,37℃,5%CO2培养,16h后其融合达60%—70%,用靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒以MOI为40感染细胞,添加polybrene,终浓度为8mg/ml。28h后去除病毒液,更换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养。3.有限稀释法获得单克隆细胞株,对所得的各单克隆细胞株进行扩大培养4.应用荧光定量PCR及Western blot检测各克隆PRL-3及CDH22基因mRNA和蛋白的表达水平,综合二者结果,鉴定出在mRNA及蛋白表达水平PRL-3及CDH22基因均显著降低的克隆株,从而建立PRL-3和CDH22双基因表达沉默的结直肠癌细胞模型,命名为SW480/PRL-3-/CDH22-。5.细胞蜡块、流式细胞术、MTT法、比较SW480/PRL-3-/CDH22-与对照组SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-在细胞形态、细胞生长周期、细胞增殖能力方面的差异。6.免疫细胞化学检测SW480/PRL-3-/CDH22-及其同一亲本来源的对照组细胞株β-catenin/Wnt信号转导通路相关蛋白表达情况。结果1.慢病毒滴度测定收集病毒上清液,测定慢病毒的病毒滴度为8×10~5U/ml。2.细胞二次感染后进行克隆化培养:经有限稀释法共获得17个单克隆细胞株,对所得的各单克隆细胞株进行扩大培养。3.PRL-3和CDH22双基因表达沉默的结直肠癌细胞模型的建立及鉴定荧光定量PCR的结果显示,挑取的各个单克隆都有不同程度CDH22基因的表达,通过公式计算,发现克隆2的干扰效率最高,表达量仅为对照的25%,即干扰效率为75%,其次是克隆1,表达量仅为对照的27%,即干扰效率为73%。荧光定量PCR结果显示,挑取的各个单克隆均有不同程度PRL-3基因的表达,通过公式计算,发现克隆4的干扰效率最高,表达量仅为对照的27%,即干扰效率为73%,其次是克隆1,表达量仅为对照的30%,即干扰效率为70%。通过荧光定量PCR初步得到4个可能符合实验预期目的克隆株。Western Blot进一步检测这4个克隆株PRL-3及CDH22蛋白表达水平。综合考虑荧光定量PCR、Western Blot的结果,证实PRL-3及CDH22稳定表达敲低的细胞克隆为克隆1,命名为SW480/PRL-3-/CDH22-。4.PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞的体外生物学特性的改变细胞蜡块HE染色显示:SW480/PRL-3-较SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock细胞胞浆丰富,细胞连接紧密,SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock3组细胞之间差异不显著。应用MTT法,我们检测SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-、SW480/PRL-3-/CDH22-细胞体外增殖能力,经析因方差分析,四组差异具有显著性(F=952.067,P=0.000);经LSD法多重比较,结果表明,SW480细胞增殖速度最快,SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-细胞次之,而SW480/PRL-3-细胞的增殖速度最慢。应用流式细胞术分析细胞周期变化,SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-及SW480/PRL-3-四种细胞的S期细胞平均比例分别为46.6%、38.3%、30.9%和20.8%,统计分析结果显示四种细胞的S期差异有统计学意义(F=42.994,P=0.000)。SW480/PRL-3-细胞大部分阻滞在G1期,S期所占比例明显减少。5.PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞及对照组细胞株β-catenin/Wnt信号转导通路相关蛋白表达情况细胞免疫化学实验显示:1) SW480及SW480/Mock细胞E-cadherin在胞膜表达呈不同程度缺失;SW480/PRL-3-/CDH22-细胞胞膜呈间断性或异位表达,但并未出现明显的膜表达缺失;SW480/PRL-3-细胞几乎所有细胞E-cadherin成明显的胞膜着色。2) SW480及SW480/Mock细胞β-catenin膜表达缺失明显;SW480/PRL-3-/CDH22-细胞β-catenin从细胞浆转移到细胞核膜及核周区域;SW480/PRL-3-细胞β- catenin重新定位于细胞膜。3) CyclinD1阳性着色定位于细胞核。SW480及SW480/Mock细胞约85%的细胞CyclinD1呈核阳性表达,SW480/PRL-3-/CDH22-细胞约50%细胞呈核阳性表达,SW480/PRL-3-细胞约30%的细胞呈核阳性表达。4) 4组细胞株CK均呈细胞膜阳性表达,无显著差异。5) 4组细胞株Vimentin均未见阳性表达。6) Gsk-3β在4组细胞中表现为胞浆表达。其表达强度依次为:SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480/PRL-3-、SW480/mock、SW480。结论1.转染一种基因慢病毒干扰载体的细胞株可再次接受靶向另一基因干扰序列的慢病毒颗粒的转染,为研究慢病毒二次感染细胞并稳定干扰各靶基因的表达提供有实用价值的实验方法。2.成功建立PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型。3.PRL-3、CDH22表达呈现不同水平时,Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白表达强度及部位发生改变。单独下调PRL-3基因,CDH22表达上调,细胞株细胞膜E-cadherin恢复连续线性表达,细胞质或细胞核中的β-catenin重新定位于细胞膜,细胞核cyclinD1低表达。细胞之间连接变紧密,细胞增殖相对减慢,细胞阻滞在G1期,S期所占比例明显减少。4.PRL-3基因可通过下调CDH22表达而诱导β-Catenin向细胞核聚集,从而激活Wnt信号靶基因cyclinD1的表达,导致结直肠癌细胞增殖加快。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-16
前言  16-25
技术路线  25-26
第一章建立PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型  26-39
  一、材料与方法  26-33
  二、结果  33-37
  三、讨论  37-38
  参考文献:  38-39
第二章同时下调PRL-3及CDH22基因引起的生物学效应  39-49
  一、材料和方法  39-40
  二、结果  40-45
  讨论  45-48
  参考文献:  48-49
第三章探讨PRL-3/CDH22对β-catenin/Wnt信号转导通路相关基因的影响  49-63
  一、材料和方法  50-51
  二、结果  51-58
  讨论  58-62
  参考文献:  62-63
全文小结  63-64
附录  64-65
致谢  65-67
研究生毕业论文统计学审稿证明  67

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