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萝卜霜霉病抗性鉴定与相关基因克隆

作　者: 高相敏
导　师: 龚义勤；柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜 霜霉病 抗性鉴定 防御酶 遗传分析 抗病基因 基因克隆
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


萝卜(Raphanus sativus L.)是原产于我国的重要蔬菜作物,为十字花科萝卜属一二年生草本植物。由寄生霜霉菌(Hyalonosporan parasitica)侵染产生的霜霉病是十字花科蔬菜上的重要病害。近几年,春季萝卜霜霉病的发生严重,尤其是在温度适宜,潮湿的环境下更易发生,此病害在萝卜生长的子叶期、苗期及成株期都容易发生,严重影响了萝卜的产量和品质。因此,萝卜抗病育种是目前重要的育种目标之一。十字花科蔬菜霜霉病的研究主要集中在芸薹属蔬菜,如白菜、甘蓝、花椰菜及青花菜等作物上。萝卜霜霉病抗性的研究刚刚起步,而萝卜霜霉病抗性鉴定的综合评价体系还未建立,其生理指标、抗性遗传及抗病基因方面的研究国内外还未见报道,限制了萝卜霜霉病抗病育种的进展及新品种选育工作。因此,本研究从抗性评价体系建立、生理指标的抗性反应、抗性遗传机制及抗病基因克隆四个方面对萝卜霜霉病的生理基础及遗传学基础进行了较为系统的研究,为萝卜种质资源的抗性评价及抗霜霉病品种的选育提供了理论依据及技术参考。采用田间自然发病与室内接种鉴定相结合的方法,对本实验室的萝卜种质资源进行霜霉病抗性筛选,建立了萝卜植株子叶期、苗期及成株期的霜霉病病害评价体系。对500个萝卜种质的田间霜霉病抗性进行了鉴定,发现叶簇平展、皮色为红色或青色、株型为塌地型的萝卜植株更容易感染霜霉病。选取20个萝卜材料进行室内人工接种鉴定,结果显示高抗品种在其生长的整个过程中都表现较好的抗性,高感材料子叶期病害尤其严重,且此鉴定结果与田间自然条件下的病害表现一致。对植株进行抗性相关性分析表明,子叶期及苗期分别与成株期抗性呈显著性正相关关系(相关系数R2=0.9778,R2=0.8519)。因此,萝卜子叶期或苗期的病害表现可以反映其成株期的抗性情况。对多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性与萝卜霜霉病抗性的关系进行了研究。结果表明,抗病材料在接种病原菌不同时段后,植株体内PPO、POD、CAT、SOD与萝卜抗病性呈显著正相关,且分别在不同的处理时间达到峰值；方差分析显示,各个酶活性的峰值与其他接种时段相比,差异达到极显著水平。而感病自交系中的防御酶活性与植株抗病性无相关性,方差分析差异不显著。表明植株防御酶活性可作为萝卜霜霉病抗性鉴定的辅助评价指标。以萝卜抗感病材料NAU-XBY06 x NAU-SH08,NAU-DHP07×NAU-BJQ09配制的P1, P2, F1, F2,BC1, BC2六世代为材料进行了萝卜霜霉病抗性遗传分析。分析结果表明,两个杂交组合的所有F1都表现高抗病；F2群体的抗感分离比接近3：1；与抗病亲本回交的BC群体都是抗病的,而与感病群体回交的BC群体则呈现1：1的分离。由此得出,萝卜苗期霜霉病的抗性符合单基因显性遗传模式,且F2及BC群体的正反交无差异,表明此抗性无母性遗传效应。根据拟南芥霜霉病抗病基因的保守结构域设计引物,以萝卜高抗病自交系NAU-XBY06的基因组DNA为模板,进行PCR特异扩增。结果得到了长度为2372bp,924bp,636bp及607bp的抗病基因片段,分别命名为Rs-dml,Rs-dm2,Rs-dm3,Rs-dm4。分析其核苷酸及蛋白质结构表明,Rs-dml与拟南芥霜霉病抗病基因RPP8同源性达61%；推测其氨基酸序列具有NBS-LRR类型的保守区域。Rs-dm2, Rs-dm3,Rs-dm4的NCBI及同源树分析表明,它们分别与拟南芥的霜霉病抗病基因RPP1, RPP5及RPP27有较高的同源性,且推测它们的蛋白质结构分别具有TIR-NBS-LRR保守域及蛋白质接收器(RLP)。本研究克隆得到的与萝卜霜霉病抗性相关的基因为以后萝卜霜霉病抗性分子机制的深入研究提供技术参考与理论基础。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
引言  12-13
第一章 文献综述植物霜霉病抗性研究进展  13-21
  1 霜霉菌与病害接种鉴定方法  13-16
    1.1 病原菌形态及分类  13-14
    1.2 霜霉病发病症状  14
    1.3 病原菌离体培养与保存  14-15
    1.4 霜霉病人工接种鉴定方法  15-16
      1.4.1 子叶期鉴定方法  15
      1.4.2 苗期鉴定方法  15
      1.4.3 成株期鉴定方法  15-16
  2 霜霉病抗性生理机制  16-18
    2.1 寄主与病原菌识别  16
    2.2 植物生理生化与抗病性  16-18
      2.2.1 多酚氧化酶  16-17
      2.2.2 过氧化物酶  17
      2.2.3 过氧化氢酶  17
      2.2.4 超氧化物歧化酶  17-18
  3 植物霜霉病抗性遗传学特性研究  18-21
    3.1 蔬菜霜霉病抗性遗传机制  18-19
    3.2 抗病相关基因  19-21
第二章 萝卜霜霉病抗性鉴定  21-33
  1 材料与方法  22-25
    1.1 供试材料  22
    1.2 试验方法  22-25
      1.2.1 田间自然发病情况调查鉴定  22
      1.2.2 人工接种鉴定  22-25
        1.2.2.1 病原菌收集及接种液制备  22
        1.2.2.2 子叶期人工接种  22-23
        1.2.2.3 真叶期室内接种  23
        1.2.2.4 成株期人工接种  23-25
      1.2.3 病情指数计算与抗病评价  25
  2 结果与分析  25-31
    2.1 萝卜霜霉病病原菌鉴定  25
    2.2 萝卜种质不同发育时期田间自然发病鉴定  25-26
    2.3 萝卜种质人工接种鉴定  26-30
      2.3.1 子叶期霜霉病抗性鉴定  26-27
      2.3.2 真叶期抗性鉴定  27-29
      2.3.3 萝卜成株期病原回接鉴定  29-30
    2.4 子叶期及苗期抗性与成株期抗性相关性分析  30-31
  3 讨论  31-33
    3.1 抗性鉴定意义  31-32
    3.2 萝卜霜霉病病害评价体系建立  32
    3.3 抗性相关性分析  32-33
第三章 萝卜植株接种霜霉菌后防御酶活性变化分析  33-41
  1 材料与方法  34
    1.1 供试材料  34
    1.2 试验方法  34
      1.2.1 病原菌制备  34
      1.2.2 接种与采样  34
      1.2.3 酶液提取及酶活性测定  34
  2 结果与分析  34-39
    2.1 萝卜抗感病自交系感染霜霉菌后PPO活性变化  34-36
    2.2 不同材料感染霜霉菌后POD活性变化  36-37
    2.3 不同材料感染霜霉菌后CAT活性变化  37-38
    2.4 霜霉菌对SOD活性影响  38-39
  3 讨论  39-41
    3.1 霜霉菌对PPO活性影响  39
    3.2 POD活性对霜霉菌侵染反应  39
    3.3 CAT与萝卜霜霉病抗性关系  39
    3.4 SOD活性对霜霉菌的反应研究  39-40
    3.5 生理指标辅助抗性鉴定意义  40-41
第四章 萝卜霜霉病抗性遗传机制分析  41-47
  1 材料与方法  42
    1.1 试验材料  42
    1.2 试验方法  42
      1.2.1 试验材料准备  42
      1.2.2 病原菌制备  42
      1.2.3 接种方法  42
      1.2.4 病害鉴定  42
  2 结果与分析  42-45
    2.1 萝卜种质六世代群体病害评价  43-45
    2.2 霜霉病抗性遗传分析  45
      2.2.1 NAU-XBY06×NAU-SH08抗性遗传分析  45
      2.2.2 NAU-DHP07×NAU-BJQ09遗传分析  45
  3 讨论  45-47
第五章 萝卜霜霉病抗性相关基因克隆  47-58
  1 材料与方法  48-51
    1.1 植物材料  48
    1.2 方法  48-49
      1.2.1 基因组DNA提取  48
      1.2.2 引物设计  48-49
      1.2.3 霜霉病抗性相关基因特异扩增  49
      1.2.4 PCR产物检测  49
    1.3 霜霉病抗性相关基因的克隆与分析  49-51
      1.3.1 霜霉病抗性相关基因克隆  49
      1.3.2 目的片段回收  49
      1.3.3 大肠杆菌感受态制备  49-50
      1.3.4 重组质粒构建  50
      1.3.5 重组质粒转化  50-51
      1.3.6 质粒提取及重组质粒鉴定  51
      1.3.7 序列测定及分析  51
  2 结果与分析  51-56
    2.1 霜霉病抗性相关基因扩增  51
    2.2 Rs-dm1基因的序列分析  51-55
      2.2.1 Rs-dm1核苷酸序列及蛋白质结构分析  51-54
      2.2.2 Rs-dm1核苷酸序列同源性分析  54-55
    2.3 Rs-dm2,Rs-dm3及Rs-dm4基因序列分析  55-56
      2.3.1 核苷酸序列及蛋白质结构分析  55
      2.3.2 核苷酸序列同源性分析  55-56
  3 讨论  56-58
全文结论  58-59
参考文献  59-65
发表论文情况  65-66
致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 根菜类（直根类） > 萝卜
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