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松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2克隆和序列分析及RNAi研究

作　者: 熊玉芬
导　师: 李红梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 松材线虫 乙酰胆碱酯酶基因 RACE Southern杂交 RNAi
分类号: S763.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


松材线虫是松树萎蔫病(Pine wilt disease)的病原,通过介体天牛传播病害,自1982年在江苏南京首次发现后,目前松材线虫已经蔓延至我国14个省(自治区、直辖市)的192个县级行政区,使我国松林资源与生态平衡遭到严重破坏,经济损失巨大。目前对松材线虫的研究主要集中在松材线虫的生物学、分类鉴定、松材线虫病发生条件和防治方法等方面,而关于松材线虫致病性的分子机理知之甚少。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)是生物神经传导中的一种关键性酶,除了神经学功能外,还可能涉及细胞凋亡和寄生线虫细胞发育、行为调控及侵染致病等多个生理进程。松材线虫AChE基因克隆的相关研究尚未见报道,本论文通过反转录PCR (RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了松材线虫AChE基因Bx-ace-2的cDNA全长,研究了该基因的内含子及外显子的排列结构；通过Southern杂交技术检测了该基因在基因组中的拷贝数；通过氨基酸序列比对分析,构建了乙酰胆碱酯酶基因的进化树；利用RNAi技术对克隆的Bx-ace-2进行了松材线虫体外干涉的初步研究。研究结果为今后进一步开展对松材线虫乙酰胆碱酯酶基因功能分析,从而推进对松材线虫致病分子机制的理解打下基础。1松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2克隆和分析克隆的Bx-ace-2 cDNA全长为2010 bp,有1878 bp的开放阅读框(ORF),推测其编码的蛋白有625个氨基酸；Bx-ace-2基因组克隆长为2192bp,含有7个内含子,Southern杂交实验表明该基因在松材线虫基因组中以单拷贝存在。氨基酸序列比对和同源性分析显示,Bx-ace-2编码的乙酰胆碱酯酶与已报道的秀丽小杆线虫ACE-1、ACE-3和ACE-4型乙酰胆碱酯酶的相似性在28%-31%之间,而与秀丽小杆线虫ACE-2及甘薯茎线虫、南方根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯白线虫和胎生网尾线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列相似性在44%-52%之间；构建的系统进化树也显示了松材线虫乙酰胆碱酯酶与其它线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶具有相对更近的遗传距离,因此推测该松材线虫乙酰胆碱酯酶也属于ACE-2型。2松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的RNAi研究研究了松材线虫吞咽FITC过程,浸泡10 h后松材线虫吞咽明显,24 h后线虫全身荧光信号最强。以Bx-ace-2 cDNA为模板,体外转录合成dsRNA,对经过不同dsRNA浸泡液处理24小时后的松材线虫进行RT-PCR检测显示,ace dsRNA浸泡处理后的松材线虫Bx-ace-2的转录水平明显降低,而经gfp dsRNA浸泡处理后的松材线虫没有检测到Bx-ace-2的转录水平变化。对处理后线虫的表型观察显示,ace dsRNA浸泡处理对松材线虫的活力没有明显影响,同时未发现线虫的贲门收缩的差异；浸泡液中加入脂质体对RNA干涉作用的影响不明显；松材线虫的灰葡萄孢接种实验显示经ace处理的松材线虫繁殖力明显低于对照。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语  10-11
上篇 文献综述  11-33
  第一章 松树萎蔫病概述  12-21
    1 松材线虫的分类学地位  12
    2 松材线虫形态学特征  12
    3 松材线虫的分布与为害  12-14
    4 松材线虫寄主范围及传播方式  14-16
    5 松材线虫病的致病机理  16-19
      5.1 病因的研究  16-17
      5.2 松材线虫病致病机理的研究  17-19
    6 松材线虫的致病基因的克隆  19-21
  第二章 乙酰胆碱酯酶研究进展  21-29
    1 乙酰胆碱酯酶概述  21
    2 乙酰胆碱酯酶的分子类型  21-22
    3 乙酰胆碱酯酶的结构  22-25
      3.1 AChE的高级结构  22-23
      3.2 AChE的功能位点  23-25
    4 AChE的功能  25-26
      4.1 AChE的催化功能  25
      4.2 AChE的非催化功能  25-26
    5 线虫乙酰胆碱酯酶研究进展  26-29
  第三章 植物寄生线虫RNAi的研究进展  29-33
    1 RNAi作用机制  29-30
    2 线虫RNAi机制的特点  30-31
    3 植物寄生线虫RNAi研究  31-33
下篇 研究内容  33-66
  第一章 松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的克隆与分析  34-54
    1 材料与方法  36-47
      1.1 线虫的培养与分离  36
      1.2 松材线虫基因组DNA的提取及测定  36
      1.3 松材线虫总RNA的提取  36-37
      1.4 RACE克隆全长cDNA  37-43
      1.5 乙酰胆碱酯酶基因组DNA序列的获得  43-44
      1.6 Southern blot  44-47
      1.7 乙酰胆碱酯酶基因的生物信息学分析  47
    2 结果  47-53
      2.1 松材线虫Bx-ace-2的克隆及序列分析  47-49
      2.2 Bx-ace-2的Southem Blot  49-50
      2.3 松材线虫BX-ACE-2的氨基酸序列分析  50-53
    3 讨论  53-54
  第二章 松材线虫乙酰胆碱酯酶基因体外RNAi研究  54-66
    1 材料方法  55-59
      1.1 主要试剂  55-56
      1.2 线虫培养、分离与收集  56
      1.3 体外线虫浸泡实验  56
      1.4 体外RNA干涉  56-59
    2 结果  59-63
      2.1 线虫吞咽效果  59-61
      2.2 Bx-ace-活体外RNA干涉  61
      2.3 dsRNA处理后Bx-ace-2表达水平检测  61-62
      2.4 dsRNA处理后线虫活力检测  62-63
      2.5 dsRNA处理后线虫取食检测  63
    3 讨论  63-66
全文结论  66-68
  1. 松材线虫乙酰胆碱醋酶基因Bx-ace-2的克隆及功能分析  66
  2. 松材线虫RNAi条件的研究  66-68
参考文献  68-76
附录  76-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林保护学 > 森林病虫害及其防治 > 虫害及其防治
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