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泥鳅Dmrt1基因的克隆、表达和选择性剪接分析

作　者: 赵洁
导　师: 常重杰
学　校: 河南师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 泥鳅 Dmrt1基因选择性剪接 RACE 原位杂交
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

果蝇的性别决定基因dsx与线虫的性别决定基因Mab-3的DNA序列比较表明二者具有一个高度同源的区域,称为DM基序。该基序可以与DNA进行序列特异性结合。进一步的研究发现在哺乳类、鸟类、爬行类以及鱼类等脊椎动物中也存在具有DM基序的基因,称为DMRT(Doublesex and Mab-3 related transcription factor,DMRT,Doublesex和Mab-3相关的转录因子)基因家族。其中Dmrt1基因是迄今为止该家族成员中研究最为深入的转录调控因子之一,也是目前发现的第一个在种属间具有进化保守性的性别分化相关基因,在动物性别决定过程中发挥重要作用。鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的地位,是性别决定研究的重要载体。因此对鱼类中Dmrt1基因相关信息的研究,不仅有助于了解Dmrt1基因的进化、作用方式及其具体功能等,更有助于揭示鱼类中性别决定及分化体系的运行机制,进而促进阐明脊椎动物的性别决定和分化体系的进化历程。本研究根据已经公开发表的相关Dmrt1基因资料,针对保守序列设计了一对简并引物,利用RT-PCR的方法克隆出了泥鳅的Dmrt1基因的DM保守盒,并结合RACE技术获得了Dmrt1基因的全长cDNA。结果表明:泥鳅Dmrt1基因外显子的缺失产生了多种拼接形式,共得到六条Dmrt1基因,分别记为MaDmrt1a1(2162 bp)、MaDmrt1a2(2042 bp)、MaDmrt1a3(1993 bp)、MaDmrt1a4(848 bp)、MaDmrt1b(1840 bp)和MaDmrt1c(666 bp),它们都含有DM基序和polyA尾。其中MaDmrt1a1~4具有相同的开放阅读框,包含完整的5个外显子,编码267个氨基酸,其差异主要在于3′非翻译区长度和序列不同;MaDmrt1b缺失第4个外显子,编码219个氨基酸;MaDmrt1c缺失第4和第5个外显子,保留了一段长36bp内含子,编码182个氨基酸。为了研究两种泥鳅Dmrt1基因在成体不同组织和胚胎发育不同时期的时空表达模式,采用了半定量、实时荧光定量RT-PCR、组织原位杂交和胚胎整体原位杂交技术。结果表明:泥鳅Dmrt1基因只在精巢中强烈表达,而在卵巢中不表达或只有极微弱表达,这与其它物种中的研究结果相一致;在胚胎发育的各个时期泥鳅Dmrt1基因均有表达,但表达强度又各不相同,呈现先上升后下降的表达趋势。综上所述,可推断泥鳅的Dmrt1与雄性性腺分化和发育具有明显的相关性。原位杂交试验结果显示:未成熟的生殖细胞(卵巢的卵原细胞、初级卵母细胞,精巢中的精原细胞和精母细胞)中表达,据此推测泥鳅Dmrt1基因可能调控泥鳅性腺的发育和分化;整体胚胎杂交表明泥鳅Dmrt1基因在体节形成期的体节中大量表达,之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很强的阳性杂交信号,孵出期以后Dmrt1基因的表达主要集中在泥鳅的脊柱、体节和头部。这些结果为阐述Dmrt1在脊椎动物体内对性别决定和性别分化的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-37
  1.1 动物的性别决定与性别分化  11-20
    1.1.1 动物的性别决定类型  11-13
    1.1.2 动物性别决定与性别分化的分子机制  13-16
    1.1.3 鱼类中的相关研究  16-20
  1.2 DMRT 基因家族  20-24
    1.2.1 DMRT 基因的发现  20
    1.2.2 DMRT 基因的分类和命名  20-21
    1.2.3 DMRT 基因家族的结构特点  21-22
    1.2.4 人，鸟，龟的DMRT 基因  22-23
    1.2.5 DMRT 基因在发育中的作用  23-24
  1.3 Dmrt1――参与性别决定的重要基因  24-26
    1.3.1 Dmrt1 基因的发现与命名  24
    1.3.2 Dmrt1 基因的分布与表达  24
    1.3.3 对Dmrt1 转录起始位点、启动子及转录调控因子的认识  24-25
    1.3.4 Dmrt1 的研究进展  25-26
  1.4 选择性剪接  26-35
    1.4.1 mRNA 剪接的基本模式  27-29
    1.4.2 选择性剪接的基本形式  29-30
    1.4.3 选择性剪接的生物学意义  30-32
    1.4.4 选择性剪接的研究技术  32-35
  1.5 本研究的目的和意义  35-37
2 材料与方法  37-52
  2.1 实验材料  37-41
    2.1.1 实验动物  37
    2.1.2 分子克隆所用的宿主菌株和载体  37
    2.1.3 主要仪器设备  37-38
    2.1.4 主要试剂  38
    2.1.5 引物  38
    2.1.6 本研究常用溶液配方  38-41
  2.2 实验方法  41-52
    2.2.1 总RNA 的制备  41
    2.2.2 反转录反应  41-42
    2.2.3 泥鳅Dmrt1 基因保守区序列的克隆和测序  42-45
    2.2.4 利用RACE 方法扩增泥鳅Dmrt1 基因全序列  45-46
    2.2.5 序列分析和进化树的构建  46
    2.2.6 泥鳅Dmrt1 基因的表达模式分析  46-47
    2.2.7 泥鳅Dmrt1 基因的原位杂交分析  47-52
3 结果与分析  52-74
  3.1 泥鳅Dmrt1 基因cDNA 全长的克隆  52-55
    3.1.1 泥鳅精巢总RNA 的提取  52
    3.1.2 DM 保守区的克隆  52-53
    3.1.3 cDNA 全长的克隆  53-55
  3.2 泥鳅Dmrt1 基因的序列分析和聚类分析  55-69
    3.2.1 序列分析  55-62
    3.2.2 泥鳅 Dmrt1 选择性剪接模式分析  62-64
    3.2.3 聚类分析  64-69
  3.3 泥鳅Dmrt1 基因的表达模式分析  69-74
    3.3.1 半定量RT-PCR  69
    3.3.2 荧光实时定量RT-PCR  69-70
    3.3.3 组织原位杂交分析  70-73
    3.3.4 胚胎整体原位杂交分析  73-74
4 讨论  74-80
  4.1 Dmrt1 基因的保守性分析  74-75
  4.2 Dmrt1 基因的表达分析及功能预测  75-77
  4.3 泥鳅Dmrt1 基因的选择性剪接  77-78
  4.4 结语和展望  78-80
参考文献  80-88
致谢  88-89
攻读学位期间发表的学术论文  89-90

泥鳅Dmrt1基因的克隆、表达和选择性剪接分析

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