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甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达

作　者: 连玲
导　师: 陈由强；叶冰莹
学　校: 福建师范大学
专　业: 植物学
关键词: 甘蔗 UGPase 基因克隆 载体构建
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 34次
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内容摘要


UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase,尿甘二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)是植物糖代谢的主要参与酶之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究以甘蔗(FN95-1702)为材料,通过RT-PCR,首次克隆得到了甘蔗UGPase基因cDNA片段。该片段长1495 bp,其中包含的ORF为1431 bp,共编码476个氨基酸。将其与NCBI中其它植物的UGPase基因进行比对,与玉米、大麦、绿竹的相似性分别为94%、88%和88%。另外,采用RACE技术(Rapid Amplification ofcDNA Ends,cDNA末端快速扩增)克隆获得了甘蔗叶UGPase基因cDNA的5′及3′端序列,其中5′端序列长为91 bp,克隆得到的两个3′端片段长分别为215 bp及316 bp。同时,提取甘蔗(FN95-1702)叶片的基因组,通过PCR的方法,克隆得到了甘蔗UGPase基因DNA片段。该片段长为2617 bp,序列包含13个外显子,其中11个为完整的外显子,序列还包含了12个内含子。将甘蔗UGPase基因cDNA片段连接至载体pBI121,成功构建了植物表达载体。并通过农杆菌的介导,采用浸花法转化拟南芥,经抗性筛选及鉴定,初步确定获得了4棵转基因苗。为进一步对UGPase的相关功能进行研究奠定了基础。另外,将甘蔗UGPase基因cDNA片段与原核表达载体pQE-30相连接,经鉴定表明,表达载体构建正确,为下一步的原核表达研究作好了前期的准备。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-4
中文文摘  4-6
目录  6-10
绪论  10-22
  一、研究背景  10
  二、UGPase及UGPase基因研究进展  10-20
    1.UGPase的生物学功能  10-13
      (1) UGPase与蔗糖代谢  11
      (2) UGPase参与细胞壁的形成  11-13
    2.UGPase的定位、结构及酶学特征  13-16
      (1) UGPase的定位  13
      (2) UGPase的三维结构  13-14
      (3) UGPase的酶学特征  14-16
    3.UGPase基因及其表达与调控  16-19
      (1) UGPase基因  16-17
      (2) UGPase的进化分析  17-18
      (3) UGPase基因的表达调控  18-19
    4.转UGPase基因研究  19-20
  三、本研究的目的和意义  20-22
第一章 甘蔗UGPase基因的克隆及序列分析  22-42
  第一节 前言  22
  第二节 材料与试剂  22-23
    1.2.1 植物材料  22
    1.2.2 菌株  22
    1.2.3 主要试剂  22-23
  第三节 方法  23-33
    1.3.1 甘蔗UGPase基因cDNA片段的克隆  23-28
      1.3.1.1 甘蔗叶与茎总RNA的提取  23
      1.3.1.2 PCR引物设计  23
      1.3.1.3 甘蔗叶与茎cDNA一链的合成  23-24
      1.3.1.4 PCR反应及其产物回收  24-25
      1.3.1.5 PCR回收产物的连接及转化  25-26
      1.3.1.6 重组质粒的提取与鉴定  26-28
      1.3.1.7 测序及序列分析  28
    1.3.2 甘蔗UGPase基因cDNA的5′UTR及3′UTR的扩增  28-31
      1.3.2.1 甘蔗叶总RNA的提取  28
      1.3.2.2 引物设计  28
      1.3.2.3 cDNA一链的合成  28
      1.3.2.4 PCR扩增5′UTR及3′UTR  28-29
      1.3.2.5 PCR回收产物的连接及转化  29-30
      1.3.2.6 重组质粒的提取与鉴定  30
      1.3.2.7 测序及序列分析  30-31
    1.3.3 甘蔗UGPase基因DNA片段的克隆  31-33
      1.3.3.1 甘蔗叶基因组DNA的提取  31
      1.3.3.2 PCR引物设计  31-32
      1.3.3.3 PCR反应及其产物回收  32
      1.3.3.4 PCR回收产物的连接及转化  32
      1.3.3.5 重组质粒的提取与鉴定  32-33
      1.3.3.6 测序及序列分析  33
  第四节 结果与分析  33-39
    1.4.1 甘蔗UGPase基因cDNA片段的克隆  33-36
    1.4.2 甘蔗UGPase基因cDNA 5′UTR及3′UTR的扩增  36-37
    1.4.3 甘蔗UGPase基因DNA片段的克隆  37-39
  第五节 讨论  39-42
第二章 甘蔗UGPase植物表达载体构建及转化拟南芥  42-56
  第一节 前言  42
  第二节 材料与试剂  42-43
    2.2.1 植物材料  42
    2.2.2 菌株及质粒  42
    2.2.3 主要试剂  42-43
  第三节 方法  43-49
    2.3.1 甘蔗UGPase植物表达载体的构建  43-47
      2.3.1.1 甘蔗UGPase-L基因的扩增  43-44
      2.3.1.2 植物表达载体的构建  44-46
      2.3.1.3 连接产物的转化  46
      2.3.1.4 重组质粒的提取与鉴定  46-47
    2.3.2 转化农杆菌GV3101  47-48
      2.3.2.1 农杆菌感受态的制备  47
      2.3.2.2 重组质粒转化农杆菌  47
      2.3.2.3 农杆菌的鉴定  47-48
    2.3.3 转化拟南芥  48-49
      2.3.3.1 花序浸染法转化拟南芥  48-49
      2.3.3.2 拟南芥抗性苗的筛选  49
      2.3.3.3 拟南芥抗性苗的鉴定  49
  第四节 结果与分析  49-52
    2.4.1 甘蔗UGPase植物表达载体的构建  49-50
    2.4.2 农杆菌转化子的鉴定  50-51
    2.4.3 拟南芥抗性苗的筛选  51
    2.4.4 拟南芥抗性苗的鉴定  51-52
  第五节 讨论  52-56
第三章 甘蔗UGPase原核表达载体的构建  56-64
  第一节 前言  56
  第二节 材料与试剂  56
    3.2.1 菌株及质粒  56
    3.2.2 主要试剂  56
  第三节 方法  56-60
    3.3.1 甘蔗UGPase-L基因的扩增  56-57
    3.3.2 原核表达载体的构建  57-59
      3.3.2.1 pQE表达系统  57-58
      3.3.2.2 载体构建  58-59
    3.3.3 连接产物的转化  59
    3.3.4 重组质粒的提取与鉴定  59-60
  第四节 结果与分析  60
  第五节 讨论  60-64
第四章 结论  64-66
附录1 常用试剂、溶液配方  66-68
附录2 MS培养基的配置  68-70
附录3 符号缩略表  70-72
参考文献  72-78
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  78-80
致谢  80-82
个人简历  82

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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