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重组鸡白细胞介素-2的复性及其生物学活性

作　者: 吴佳俊
导　师: 周继勇
学　校: 浙江大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡重组白细胞介素2 纯化复性生物学活性二硫键
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 8次
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内容摘要

利用pET-28a(+)系统表达的重组鸡白细胞介素2(rchIL-2)主要以不溶性的包涵体形式表达。为了优化rchIL-2蛋白的制备工艺、提高收率,分析重组chIL-2蛋白的组分,本研究在提高可溶性rchIL-2产量表达工艺、菌体裂解工艺、纯化工艺及单体分离方面进行了探索,取得以下结果：1)在可溶性rchIL-2表达工艺方面,基因工程菌液的OD600值为1.5时加入0.01mmol/L IPTG进行诱导表达3小时是pET-28a(+)系统可溶性表达rchIL-2的最佳工艺,可溶性rchIL-2的表达量达到4mg/L左右。2)在基因工程菌体破碎方面,通过对冻融、溶菌酶和超声波的优化,证明在400瓦条件下超声波处理360秒是最佳细菌破碎工艺；3)在可溶性rchIL-2的纯化工艺方面,通过对纯化填料、pH值和载量的优化,证明应用Ni2+亲和层析柱在pH 7.4缓冲体系、30mM咪唑杂蛋白洗脱和250mM咪唑目的蛋白洗脱环境中获得3mg/L的可溶性rchIL-2；4)在不溶性chIL-2纯化工艺方面,通过对包涵体洗涤条件、包涵体裂解条件、纯化填料、pH值和载量的优化,证明应用Ni2+亲和层析柱在2M尿素和3000rpm离心洗涤包涵体、pH8.0的6M盐酸胍缓冲液裂解包涵体、小体积上样(2.4ml上样体积)、pH 6.3的6M盐酸胍缓冲液洗脱杂蛋白及250mM咪唑洗脱目的蛋白的条件下可获得37mg/LchIL-2；5)利用接有Superdex 75凝胶预装柱的AKTA UPC纯化系统,从纯化的可溶性rchIL-2蛋白中成功分离到鸡IL-2蛋白单体和二聚体,其产量分别为1mg/L和0.25mg/L.分别采用透析法和稀释法对变性纯化的鸡IL-2蛋白进行复性,ANS疏水探针测定不同条件复性产物的疏水性,在此基础上利用体外T淋巴细胞增殖实验和CCK-8比色法测定不同条件复性产物的生物学活性。复性结果显示,在稀释复性中,pH值、盐酸胍、甘油、PEG6000可以显著提高可溶性rchIL-2的回收率,当复性液pH值维持在8.5并添加3M盐酸胍或10%甘油或0.15%的PEG6000时,稀释复性法中可溶性rchIL-2回收率可达72-80%。与稀释复性法相比,透析复性法的可溶性rchIL-2回收率为31%。生物学活性测定结果显示：GSSG/GSSH终比例为1mM：2.5 mM时,复性产物的生物学活性最好,有氧和硫酸铜条件下的复性产物不具有生物学活性。表现在疏水性方面为：生物活性最好的复性产物,它的疏水值为352。将变性纯化的rchIL-2分别在使二硫键断开的10nM DTT还原条件下和保留二硫键的GSSG/GSSH氧化还原条件下进行复性,体外生物学活性和疏水性检测结果显示：处于保留二硫键状态的复性rchIL-2疏水性低、具有有良好的生物学活性,而处于二硫键断裂状态的复性rchIL-2疏水性高、生物学活性丧失。证明chIL-2分子内的二硫键对于维持其生物学活性是必需的。

全文目录

目录  6-8
摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一部分文献综述  11-25
  第一章鸡白细胞介素2的研究  11-25
    1 分子生物学研究  11-16
      1.1 鸡IL-2基因的克隆与表达  11-14
      1.2 IL-2的蛋白质结构及其二硫键  14-16
    2 鸡IL-2的纯化、复性及活性检测  16-25
      2.1 IL-2的纯化  16-19
      2.2 IL-2的复性  19-22
      2.3 IL-2的活性检测  22-25
第二部分研究内容  25-71
  第一章重组鸡白细胞介素2的制备与单体分离  25-51
    1 材料  26
      1.1 质粒、菌株及生化试剂  26
      1.2 主要酶及试剂  26
      1.3 常用缓冲液及培养基配置  26
    2 方法  26-33
      2.1 rchIL-2的原核表达和鉴定  26-30
      2.2 可溶性rchIL-2蛋白的纯化  30-31
      2.3 不溶性rchIL-2蛋白的纯化  31-33
      2.4 rchIL-2单体的分离  33
    3 结果  33-47
      3.1 rchIL-2表达蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting鉴定  33-34
      3.2 rchIL-2的可溶性分析  34
      3.3 rchIL-2诱导表达的影响因素  34-37
      3.4 表达菌的破碎  37-39
      3.5 可溶性rchIL-2的非变性纯化  39-40
      3.6 可溶性rchIL-2非变性纯化的影响因素  40-41
      3.7 包涵体的洗涤  41-42
      3.8 包涵体的裂解  42-43
      3.9 不溶性rchIL-2的变性纯化  43
      3.10 不溶性rchIL-2变性纯化的影响因素  43-44
      3.11 rchIL-2单体的制备及其优化  44-47
    4 讨论  47-51
      4.1 诱导条件的摸索  47
      4.2 表达菌的破碎  47-48
      4.3 可溶性rchIL-2的纯化  48
      4.4 包涵体的洗涤及其裂解  48-49
      4.5 不溶性rchIL-2的纯化  49
      4.6 单体的分离  49-51
  第二章重组鸡白细胞介素一2的复性及其生物学活性  51-60
    1 材料  51-52
      1.1 实验动物  51
      1.2 试剂  51
      1.3 常用缓冲液及培养基配置  51-52
    2 方法  52-54
      2.1 rchIL-2的复性  52-53
      2.2 rchIL-2复性产物体外生物活性检测  53-54
      2.3 rchIL-2复性产物的疏水性检测  54
    3 结果  54-58
      3.1 rchIL-2透析法复性折叠中点的寻找及可溶性摸索  54-55
      3.2 rchIL-2稀释法复性可溶性摸索  55-56
      3.3 rchIL-2复性产物的脱盐  56
      3.4 rchIL-2复性产物生物活性的检测  56-57
      3.5 rchIL-2复性产物疏水性的检测  57-58
    4 讨论  58-60
  第三章二硫键对重组鸡白细胞介素2生物活性的影响  60-64
    1 材料  60
      1.1 实验动物  60
      1.2 主要生物试剂  60
      1.3 常用缓冲液配置  60
    2 方法  60-61
      2.1 二硫键断开rchIL-2及对照的制备  60-61
      2.2 生物活性的检测  61
      2.3 疏水性检测  61
    3 结果  61-63
      3.1 rchIL-2变性纯化产物的非还原和还原电泳及Western-blotting鉴定  61-62
      3.2 生物活性的检测  62
      3.3 疏水性的检测  62-63
    4 讨论  63-64
  参考文献  64-71
附录常用缓冲液及培养基配方  71-77
攻读硕士期间的科研成果  77-78
致谢  78

重组鸡白细胞介素-2的复性及其生物学活性

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