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猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核共表达质粒的构建及免疫原性分析

作　者: 张振梅
导　师: 崔尚金
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪细小病毒猪圆环病毒2型 VP2基因 ORF2基因共表达质粒免疫原性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是能够引起初产母猪繁殖障碍的两种重要病原。初产母猪感染PPV后可能出现的临床症状主要为死胎、木乃伊胎和不育等现象;怀孕母猪感染PCV2后可能出现的临床症状主要为妊娠期流产、产出死亡不久的胎儿或者发育不全的弱仔等。PCV2与PPV混合感染还能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等疾病。为了制备能够同时预防PPV和PCV2两种病毒感染的DNA疫苗,本实验构建了共表达PPV-VP2基因和PCV2-ORF2基因的重组质粒PIRES-VP2-ORF2,并用构建的重组质粒进行了小鼠免疫试验,分析了重组质粒诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫反应,检测了重组质粒的安全性。分别提取PPV和PCV2的DNA,采用PCR方法扩增VP2和ORF2基因并插入到真核双表达载体PIRES,成功构建了重组质粒PIRES-VP2、PIRES-ORF2以及PIRES-VP2-ORF2。将三种重组质粒分别瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。Western-blot方法检测证明重组质粒PIRES-VP2和PIRES-ORF2在CHO细胞中可分别表达VP2蛋白和Cap蛋白,重组质粒PIRES-VP2-ORF2则可同时表达两种蛋白。分别用重组质粒PIRES-VP2、PIRES-ORF2、PIRES-VP2-ORF2、空质粒PIRES及PBS免疫4～6周龄Balb/c小鼠,免疫剂量为100μg/只,免疫部位为小鼠后肢胫前肌,先后免疫3次,每次间隔两周。首免后每周采血ELISA检测抗体,分析小鼠体液免疫应答水平。三免两周后取小鼠脾脏分别采用WST-8方法检测脾淋巴细胞增殖、流式细胞技术检测CD4+、CD8+细胞百分含量,分析小鼠细胞免疫应答水平。通过脏器病理切片及染色体DNA扩增,对重组质粒安全性进行检测。ELISA结果显示:免疫PIRES-VP2-ORF2组小鼠可同时产生抗PPV和PCV2病毒两种抗体,免疫PIRES-VP2可产生抗PPV抗体,PIRES-ORF2组小鼠可产生抗PCV2抗体;免疫空质粒组及PBS对照组小鼠不能产生抗PPV或PCV2抗体。2免后各组小鼠抗体水平显著提高。免疫重组质粒组与空质粒对照组抗体水平差异显著(p<0.05),单表达重组质粒与共表达质粒组间差异不显著(p>0.05)。淋巴细胞增殖试验结果显示:病毒性刺激可使免疫三种重组质粒组小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著提高,两对照组淋巴细胞在特异性刺激时不能产生明显增殖。流式细胞术检测结果显示:PIRES-VP2组在PPV刺激后CD4+、CD8+阳性细胞百分含量分别上升10.7%和5.3%;PIRES-ORF2组在PCV2刺激后分别上升10.1%和4.8%;PIRES-VP2-ORF2组在PPV刺激后上升12.7%和3.9%,PCV2刺激后上升12.5%和4.8%;PIRES组在PPV和PCV2分别刺激后均无明显变化。免疫试验结果表明构建的重组质粒能够引起小鼠产生体液和细胞免疫应答。安全性检测结果显示:免疫重组质粒小鼠各器官均未见显著病变,且未从各组织样品染色体基因组DNA中扩增出质粒条带。重组质粒对小鼠机体不造成损伤而且不能整合到小鼠染色体DNA上,实验结果表明重组质粒具有良好的安全性。研究证明构建的质粒PIRES-VP2-ORF2在CHO细胞中能够同时表达两种蛋白,免疫小鼠后能够诱导机体产生对PPV和PCV2两种病毒的体液和细胞免疫应答反应,并且具有良好的安全性。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-19
  1 猪细小病毒研究进展  13-15
    1.1 简介  13
    1.2 分子生物学特性  13
    1.3 VP2 基因及编码的蛋白  13-14
    1.4 诊断技术  14
    1.5 猪细小病毒疫苗研究进展  14-15
  2 猪圆环病毒研究进展  15-16
    2.1 简介  15
    2.2 分子生物学特性  15
    2.3 ORF2 基因及编码的蛋白  15-16
    2.4 诊断技术  16
    2.5 猪圆环病毒疫苗研究进展  16
  3 核酸疫苗研究进展  16-17
    3.1 核酸疫苗的特点  16-17
    3.2 影响DNA 疫苗免疫效果的因素  17
    3.3 DNA 疫苗存在的问题  17
  4 真核共表达载体  17-18
    4.1 载体质粒的特点  17-18
    4.2 双顺反子表达质粒PIRES  18
    4.3 双顺反子表达载体在DNA 疫苗中的应用  18
  5 本研究的目的和意义  18-19
第二章 PPV-VP2、PCV2-ORF2 共表达质粒的构建及体外表达  19-30
  1 材料  19
    1.1 病毒与细胞  19
    1.2 酶及主要试剂  19
    1.3 主要仪器  19
  2 方法  19-23
    2.1 PPV-VP2 和PCV2-ORF2 基因扩增引物的设计  19-20
    2.2 病毒DNA 的提取  20
    2.3 PPV-VP2 和PCV2-ORF2 基因的扩增  20
    2.4 共表达PPV-VP2 和PCV2-ORF2 基因真核质粒的构建  20-22
    2.5 重组质粒在CHO 细胞中的表达  22-23
  3 结果  23-28
    3.1 基因扩增结果  23-24
    3.2 重组质粒鉴定结果  24-27
    3.3 Western-blot 检验蛋白表达结果  27-28
  4 讨论  28-30
第三章重组质粒在小鼠体内诱导的免疫反应  30-45
  1 材料  30
    1.1 实验动物  30
    1.2 病毒、细胞和质粒  30
    1.3 酶及主要试剂  30
    1.4 主要仪器  30
  2 方法  30-34
    2.1 DNA 真核重组表达质粒的大量制备  30-31
    2.2 重组质粒免疫小鼠方案  31
    2.3 诱导小鼠体液免疫效果检测  31-33
    2.4 诱导小鼠细胞免疫效果检测  33
    2.5 重组质粒安全性检测  33-34
  3 结果  34-42
    3.1 小鼠抗体ELISA 检测结果  34-35
    3.2 中和试验检测小鼠血清抗体结果  35-36
    3.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖反应  36
    3.4 免疫小鼠CD4+、CD8+细胞检测结果  36-39
    3.5 安全性结果  39-42
  4 讨论  42-45
第四章全文结论  45-46
参考文献  46-51
致谢  51-52
作者简介  52

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核共表达质粒的构建及免疫原性分析

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