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猪圆环病毒Ⅱ型和猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

作　者: 李坤
导　师: 邵华斌；程国富
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪圆环病毒Ⅱ型猪瘟病毒 Cap E2 原核表达间接ELISA
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪圆环病毒(Porcine Circovius,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员,基因分型表明PCV分为两个基因型,PK15细胞源性无致病性的PCV规定为PCV1,感染断奶仔猪多系统消耗综合症(Postweaning Multisystemic WastingSyndrome,PMWS)的猪中分离的具有致病性的规定为PCV2,PCV2被认为是导致PMWS的病原,感染PMWS的猪会出现生长障碍、呼吸困难、皮肤苍白或黄疸、泻痢等症状。该病1991年在加拿大首次被报道,现在已经遍布世界各地的产猪地区。猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的猪的高度接触性传染病,以出血和发热为主要特征,呈急性、亚急性或慢性经过。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。临床表现的多变和强毒株的出现均会导致高发病率和死亡率。亚急性和慢性猪瘟由于症状不明显不能被迅速检测而造成病毒的散播。猪瘟间歇性的暴发给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2的核衣壳蛋白(Capsid,Cap)和CSFV的囊膜蛋白E2在感染动物体内可以诱导产生保护性免疫,同时病毒感染机体后主要产生针对这两种结构蛋白的抗体。因此,这两种蛋白被认为是间接ELISA包被抗原的首选。本论文的试验由两个部分组成:一、Cap蛋白和E2蛋白分别利用pET表达系统在大肠杆菌中的表达。二、用这两种蛋白为抗原分别建立检测PCV2-Cap抗体和CSFV-E2抗体的间接ELISA方法,并对临床血清样品进行检测。主要结果如下:1.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的Cap基因,将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,将鉴定正确的重组质粒命名为pET-Cap,然后转化宿主菌E.coli BL21-codonplus(DE3),SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子量为42kDa。用RT-PCR方法从CSFV Shimen株中获得E2囊膜糖蛋白A-D抗原区基因,将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-E2,将鉴定正确的阳性重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-codonplus(DE3),SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达蛋白E2分子量约为38.6kDa。2.用表达的Cap蛋白作为包被抗原建立PCV2抗体间接ELISA方法。通过反应条件的优化得出抗原包被浓度为3μg/mL;一抗稀释度为1:400,作用时间为45min;二抗作用时间为60min;阴阳性血清的临界值分别为0.158和0.188。用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%。说明两地已有PCV2感染。用表达的E2蛋白作为包被抗原建立CSFV抗体间接ELISA方法。通过反应条件的优化得出抗原包被浓度为3μg/mL;一抗稀释度为1:100,作用时间为45min;二抗作用时间为60min;阴阳性血清的临界值分别为0.839和1.004。用该方法检测湖北武汉331份猪血清,检测结果与进口试剂盒比较,阳性率分别为41.1%和67.1%。共阳性为111份,共阴性为41份。符合率为45.9%。符合率较低的原因可能与两种方法包被抗原的不同有关。结果表明,所建立的间接ELISA方法能够分别检测出猪血清中的Cap抗体和E2抗体,可以成为有效的血清诊断工具。

猪圆环病毒Ⅱ型和猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

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