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小豆蔻明基于mTOR作用靶标的研究

作　者: 汤莹
导　师: 史道华
学　校: 福建医科大学
专　业: 药理学
关键词: mTOR FKBP12 小豆蔻明 基因转染 A549 细胞增殖
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的观察FK506结合蛋白12 (FK506 binding protein 12, FKBP12)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)基因转染人非小细胞肺癌A549细胞对增殖以及对40s核糖体蛋白s6激酶(70 kDa ribosomal protein s6 kinase, p70S6K)和白细胞介素-2(Interleukin, IL-2)的影响,并以小豆蔻明(Cardamonin, CAR)进行干预,检测]mTOR信号通路中信号分子及相关因子的表达,以明确CAR抑制细胞增殖的直接作用靶标。方法1构建真核表达载体RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12全长基因,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体；pcDNA3.0-mTOR真核表达质粒由美国印第安纳大学寿伟年教授惠赠。2鉴定重组质粒制备感受态细胞DH5a并分别转化pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12、pcDNA3.0-mTOR重组质粒,培养扩增后以碱裂解法抽提质粒,经酶切法、PCR法及DNA测序法鉴定。3建立稳定转染细胞株(1)建立稳定转染细胞株应用脂质体转染方法将两种重组表达质粒分别转染人非小细胞肺癌A549细胞,并用潮霉素B (Hygromycin B)及G418筛选得到稳定转染细胞株。(2)检测基因表达产物Western blot方法对转染前后细胞中FKBP12、mTOR基因及其相关因子的表达进行鉴定。(3)测定转染细胞株生长曲线MTT方法测定FKBP12、mTOR蛋白过表达对人非小细胞肺癌A549细胞体外增殖的影响。4验证小豆蔻明作用机制(1)实验分组将转染细胞和非转染细胞分别给药后分为空白对照组(CG),溶剂对照组(SG), RAP组(RAPG, 10-7mol·L-1),CAR1组(CARG1,3×10-5mol·L-1),CAR2组(CARG2,10-6mol·L-1)。(2)细胞增殖测定采用MTT法比较转染前后药物对细胞增殖的影响。(3)靶标相关蛋白表达测定Western blot方法检测细胞P-mTOR、P-p70S6K1、FKBP12及IL-2的表达。结果1重组质粒构建及鉴定从DH5a提取的pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12质粒浓度为379ng·μL-1, OD260/OD280为1.93; pcDNA3.0-mTOR质粒浓度为306ng·μL-1, OD260/OD280为1.89。双酶切、PCR鉴定可见目的基因片段,DNA测序亦证实其序列正确。2稳定转染细胞株建立(1)重组表达质粒pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12和pcDNA3.0-mTOR分别转染A549细胞,经Hygromycin B (250μg·mL-1)和G418(300μg·mL-1)筛选得到稳定转染的A549-FKBP12细胞株及A549-mTOR细胞株。(2) FKBP12基因转染A549后,FKBP12及IL-2蛋白的表达明显增多(P<0.01,n=3)。mTOR基因转染A549后,mTOR、P-mTOR及P-p70S6K1蛋白表达上调(P<0.01,n=3)。(3)转染的A549细胞株体外增殖速率明显加快。3小豆蔻明作用机制验证(1)CAR对三种细胞株增殖的影响①RAP抑制A549-FKBP12及A549-mTOR转染细胞株增殖作用较正常A549细胞株强(分别为0.503±0.023 vs 0.426±0.056; 0.465±0.032 vs 0.426±0.056;P<0.01)。②CAR对A549-mTOR转染细胞株增殖的抑制较正常A549细胞株强(CAR1,CAR2分别为0.456±0.023 vs 0.363±0.054; 0.316±0.028 vs 0.266±0.512; P<0.01),但对A549-FKBP12转染细胞株的增殖无影响。(2)CAR抑制细胞增殖的可能机制①RAP可抑制P-mTOR、P-p70S6K1、FKBP12及IL-2的表达及过表达(P<0.01)。②CAR干预后,仅对P-mTOR、P-p70S6K1蛋白表达及过表达有抑制作用(P<0.01),而对FKBP12、IL-2蛋白表达及过表达无显著影响。结论1 mTOR基因、FKBP12基因转染A549细胞株体外增殖加速。2 CAR与RAP均可阻断mTOR-p70S6K1信号通路,抑制A549细胞增殖。3 CAR作用机制与mTOR直接相关,不依赖FKBP12的激活。

全文目录


英文缩略词对照表  4-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
第一部分 FKBP12及mTOR真核表达载体稳定转染A549细胞株的建立  14-46
  材料与方法  14-35
  结果  35-44
  讨论  44-46
第二部分 小豆蔻明抑制A549细胞增殖作用靶标的研究  46-52
  材料与方法  46-47
  结果  47-50
  讨论  50-52
结论  52-53
参考文献  53-58
致谢  58-59
综述  59-65
已发表文章  65-71

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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