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RNA干扰介导Prohibitin基因沉默对人大肠癌细胞株生物学特性的影响

作　者: 程艳洁
导　师: 姚丽君
学　校: 福建医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: Prohibitin SiRNA RNA干扰
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 55次
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内容摘要

目的：利用RNA干扰(RNAi)技术,特异性沉默Prohibitin (PHB)基因的表达,研究PHB基因对大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的调节作用,为运用RNAi技术治疗大肠癌的可行性奠定理论和实验基础。方法：以Western blot检测PHB在多株大肠癌细胞株中表达,筛选出高表达PHB蛋白细胞株,以该株细胞为研究对象,在生长状态良好情况下瞬时转染针对靶基因PHB设计的siRNA三个特异性片段PHB138、PHB173、PHB539,以脂质体Lipofectamine2000为载体,转染所筛选出的大肠癌细胞株,72小时后,通过比较基因沉默后蛋白的表达,筛选出干扰效果最明显的两个片段,设立阴性对照和筛选出的两个siRNA片段为实验组,重新转染该株大肠癌细胞,抑制靶基因PHB表达,通过CCK-8检测、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验等检测细胞增殖能力。在奥沙利铂药物诱导基础上,通过PI和RNase流式检测细胞周期；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂流式细胞术、Caspase-3/Caspase-9活性检测等方法检测细胞凋亡；Annexin V-FITC试剂和Hoechst染色荧光显微镜观察,记录细胞典型凋亡形态和细胞核改变。结果：Western blot结果显示PHB蛋白在七株大肠癌细胞中均有表达,且在HCT 116中表达最高。靶向PHB特异性RNAi化学合成片段,瞬时转染HCT 116后,三个片段均明显抑制蛋白表达,且片段PHB138、PHB539抑制效果更好。细胞增殖能力检测结果,CCK-8法绘制细胞生长曲线发现转染siRNA沉默PHB基因后可抑制HCT 116细胞的生长；通过平板克隆和软琼脂克隆形成实验检测PHB对细胞体外成廇能力的影响,发现转染后HCT 116细胞克隆数量少于阴性对照组,平板克隆形成率分别为NC(43.4±2.11)%、PHB138(31.1±3.05)%、PHB539(12.4±1.26)%；软琼脂克隆形成率NC(8.03±0.912)‰、PHB138(4.22±0.569)‰、PHB539(2.82±0.621)%。,且干扰组与NC对照差异有统计学意义(P<0.05)。通过细胞周期分析,发现转染沉默HCT 116细胞后S期细胞比例下降,凋亡峰升高,S期比例NC(47.7±8.75)%、PHB138(33.4±0.510)%、PHB539(31.7±1.91)%；应用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒流式检测也同样发现D2区显示凋亡细胞比例增加,有统计意义(P<0.05)；Caspase-3活性度PHB138(1.50±0.392)、PHB539(1.81±0.416),Caspase-9活性度PHB138(2.02±0.435) PHB539(2.81±0.517)。Annexin V-FITC和Hoechst染色均在荧光显微镜下观测有明显的凋亡现象,且凋亡比例和强度比阴性对照强。结论：靶向PHB-siRNA干扰可以有效的沉默大肠癌细胞PHB基因,下调PHB蛋白水平,从而抑制大肠癌细胞增殖、促进大肠癌细胞凋亡；实验筛选出沉默效果较好的两个片段PHB138、PHB539实验组,为后期开展RNA体内干扰实验提供理论、技术基础；靶向干扰PHB基因为大肠癌基因治疗研究提供理论依据。

全文目录

英文缩略词表  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-30
结果  30-40
讨论  40-44
结论  44-45
参考文献  45-49
综述  49-58
致谢  58

RNA干扰介导Prohibitin基因沉默对人大肠癌细胞株生物学特性的影响

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