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mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰对大肠癌细胞杀伤效率的研究

作　者: 肖维
导　师: 张阳德
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 大肠癌 livin survivin 壳聚糖 RNA干扰基因治疗单甲氧基聚乙二醇纳米粒
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：探讨mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体的可行性。对mPEG-CS纳米粒作为基因载体转染大肠癌细胞HT-29的效率进行评价。方法：离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,静电吸附法制备载基因纳米粒。以mPEG-CS-livin shRNA为参照,Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和mPEG-CS-livin shRNA纳米粒的形态、粒径和zeta电位,测定mPEG-CS-livin shRNA纳米粒的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNaseⅠ酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳配比条件下制备的mPEG-CS-livin shRNA纳米粒转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果：成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒混悬液与基因溶液配比为3：1时,载基因纳米粒形态较规则,粒径最小,包封率为94.32±0.35%。纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的保护作用。mPEG-CS纳米载体介导的转染大肠癌细胞效率高,持续作用时间长。结论：mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,在大肠癌细胞内长时间表达。目的：研究mPEG-CS纳米载体介导的针对livin基因和survivin基因的特异性RNA干扰,比较双基因干扰与单基因干扰对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响,探索针对大肠癌凋亡的双基因干扰的可行性。方法：以最佳配比条件下制备的mPEG-CS-livin shRNA纳米粒和mPEG-CS-survivin shRNA纳米粒,联合或者分别转染大肠癌HT-29细胞。通过MTT法检测纳米载体介导的RNA干扰作用对大肠癌细胞增殖的抑制效率,利用RT-PCR及western blot分别检测livin及survivin基因的表达,Hoechst染色检测基因沉默后对细胞的凋亡诱导作用,荧光显微镜观察细胞形态。结果：MTT实验及Hoechst凋亡染色实验结果显示双基因干扰可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其细胞生长抑制作用和促细胞凋亡作用均强于单独干扰livin或survivin基因。livin和survivin双基因干扰对livin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为58.62%和59.41%,对survivin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为60.2%和61.39%。结论：mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰能降低结肠癌细胞中livin和survivin基因的表达,抑制结肠癌细胞的增殖,并诱导结肠癌细胞的凋亡,其作用较分别单独干扰livin或者survivin作用强,两者联合干扰效果具有协同增强效应。

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摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
中英文对照  9-11
前言  11-13
第一章 mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体的初步研究  13-24
  1.1 材料  13-15
  1.2 方法  15-16
  1.3 结果  16-22
  1.4 讨论  22-24
第二章纳米载体介导的livin和survivin双基因干扰对大肠癌细胞杀伤效率的研究  24-36
  2.1 材料  24-25
  2.2 方法  25-29
  2.3 结果  29-33
  2.4 讨论  33-36
参考文献  36-43
综述  43-50
  参考文献  47-50
致谢  50-51
在校期间科研成果及发表论文  51

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