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应用酿酒酵母和毕赤酵母对水稻DNA甲基转移酶生物学功能的初步研究

作　者: 董明月
导　师: 庞劲松；刘宝
学　校: 东北师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻DNA甲基转移酶 真核表达载体 酿酒酵母 毕赤酵母 表观遗传
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


DNA甲基化修饰是存在于多数真核生物中的一种重要的表观遗传修饰，DNA甲基转移酶系统在其中起着重要的作用，因此，DNA甲基转移酶的生物学功能及其作用机制受到越来越多的关注。本研究通过生物信息学方法预测得到水稻DNA甲基转移酶（OsDMT）编码基因，构建水稻DNA甲基转移酶真核表达载体，然后将其转化到没有DNA甲基化背景的酿酒酵母株系AH109中进行表达。同时选取人类的DNA从头甲基化酶DNMT3A、DNMT3B2作为实验的阳性对照。利用梯度稀释的点板（Dotting Assay）研究外转基因对酿酒酵母AH109生长状态的影响，用绿色荧光蛋白检测外转基因在酵母中的表达情况。结果显示：通过菌液PCR、双酶切鉴定及测序，得到了正确重组的pBridge_DNMT3A、pBridge_DNMT3B2、pBridge_OsDMT、pBridge_EGFP和pBridge_OsDMT_EGFP，并成功转化到酿酒酵母AH109中，得到阳性单克隆。梯度稀释的点板实验中，阳性对照组DNMT3A和DNMT3B2对酿酒酵母AH109产生了生长抑制，而实验组OsDMT对酿酒酵母的生长并无明显抑制。外转带有EGFP质粒和不带EGFP质粒的菌体在蓝光激发下均呈绿色，尚不确定外转基因是否被表达。使用MSAP分子标记技术对随机选取的单克隆个体进行全基因组范围甲基化分析，结果显示外转的hDNMT3A、DNMT3B2和OsDMT使酵母基因组DNA甲基化升高。但也发生了极个别去甲基化的现象，这有可能是细胞分裂过程中产生的序列变异造成的，需要进一步验证。为了确定它们的生物学功能，我们利用毕赤酵母表达外源蛋白在体外检测其酶活。但在本实验中只检测到了外源蛋白的转录没有检测到外源蛋白，有可能是表达量太低，需要找到合适的方法进一步研究。本研究初步探索了外转水稻DNA甲基转移酶（OsDMT）基因在酿酒酵母中的表达模式，构建的体系可用于对水稻DNA甲基转移酶的活性鉴定及检测它们在水稻中表达的时空特异性等研究。

全文目录


中文摘要  4-5
英文摘要  5-8
引言  8-12
  1. 表观遗传学  8
  2. DNA 甲基化的研究进展  8-9
    2.1 DNA 甲基化概述  8
    2.2 DNA甲基化的作用机制  8-9
  3. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）  9-10
  4.毕赤酵母（Pichia pastoris）  10
  5. 本研究的目的和意义  10-12
第一部分应用酿酒酵母对水稻DNA 甲基转移酶的生物学功能研究  12-34
  材料和方法  12-25
    1. 实验材料  12
    2. 实验方法  12-25
      2.1 酵母单杂交质粒载体的构建  12-18
      2.2 转化酿酒酵母  18-20
      2.3 EGFP 表达荧光定位  20
      2.4 表达及点板  20
      2.5 MSAP 检测预测的水稻甲基转移酶对酵母基因组甲基化的影响  20-25
  结果与分析  25-32
    1. 重组质粒构建  25-28
      1.1 pEGFP-N1 和pBridge 载体鉴定  25
      1.2 阳性对照pBridge_hDNMT3A、pBridge_hDNMT3B2 表达载体的构建  25-26
      1.3 OsDMT（DMT706CDS、DMT710-1CDS、DMT710-3CDS）表达载体的构建  26-28
    2. 重组质粒在酿酒酵母AH109 中的表达  28-32
      2.1 转化酿酒酵母AH109  28
      2.2 检测融合蛋白EGFP 的表达  28
      2.3 外转hDNMT 和OsDMT 的表达对酵母AH109 生长的影响  28-29
      2.4 外转重组质粒对酿酒酵母AH109 甲基化变异模式的影响  29-32
  讨论  32-34
第二部分应用毕赤酵母对水稻DNA 甲基转移酶的生物学功能研究  34-41
  材料和方法  34-39
    1.实验材料  34
    2.实验方法  34-39
      2.1 毕赤酵母pPIZBα_DMT706CDS 表达质粒的构建  34-35
      2.2 转化毕赤酵母  35-36
        2.2.1 质粒DNA 线性化  35
        2.2.2 制备毕赤酵母原生质细胞  35
        2.2.3 EasyComp~(TM) 转化  35-36
      2.3 筛选Mut~+转化子  36
      2.4 Mut~+分泌表达  36-37
      2.5 提取毕赤酵母DNA和RNA  37
      2.6 毕赤酵母RNA的反转录  37-38
      2.7 RT PCR  38-39
  结果与分析  39-41
    1.筛选Mut~+转化子  39
    2.Mut~+分泌表达  39
    3.RT PCR  39-41
结论  41-42
参考文献  42-45
致谢  45

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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