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甲状腺癌血DNA甲基化谱的研究

作　者: 廖萍
导　师: 王文静；刘茶珍
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 表观遗传学 甲状腺癌 甲基化芯片 DNA甲基化标志物
分类号: R736.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


肿瘤的发生是遗传和表遗传共同作用的结果。甲状腺癌抑癌基因的甲基化导致其表达抑制是甲状腺癌发生发展的重要病因之一。为探讨外周血中甲状腺癌的分子诊断标志物,构建甲状腺癌血DNA甲基化谱,本研究利用高通量的DNA甲基化芯片技术,对24例甲状腺癌病人和正常对照人群全血样本进行筛选,得到甲状腺癌血DNA差异甲基化谱。以Diffscore>20和<-20初步筛选出937个基因有意义。根据Diffscore计算出Beta score (β),采用Fisher、Pearson和Wilcoxon检验进行病例组和对照组之间位点的β值差异分析。统计学显著性筛选阈值选择p<=5E-4,29个基因在病例组中显著高表达；11个基因在病例组中低表达。当显著性阈值p<=1E-4时,则筛选出的差异甲基化基因总计8个,其中7个基因在病例组中显著高表达；1个基因在病例组中显著低表达。将芯片结果中差异表达的基因挑选出来用Pathway数据库,Motif数据库,再加上基因功能富集度(GO)分析。从生物学功能分析上可以看出,这些差异基因参与了多个生物学通路,包括G蛋白偶联信号通路、WNT信号转导通路、钙离子信号通路、代谢通路等,都是肿瘤研究中一些比较重要的生物学通路。本次研究同时结合流行病学调查的各种变量特征按阈值(p<=5E-4和p<=1E-4)分别进行建模,通过已有甲基化数据和辅助特征综合构建疾病预测模型。在阈值为p=1E-4时筛选出来的8个差异甲基化基因对于疾病预测平均准确度达到了91.67%,高于另一阈值,具有较优的预测甲状腺癌的能力。为达到验证这些基因的目的,我们分析了在病例组中显著高甲基化基因,根据文献报道、实验检测数据、已知的蛋白功能,生物学通路等信息先选择OXTR基因进行甲基化特异性PCR的验证实验,用简便易行的方法筛选出有意义的高甲基化基因。利用RAA技术扩增甲状腺癌患者与正常对照外周血小片段DNA甲基化(M)和非甲基化(U)OXTR基因各15例。其中,甲状腺癌病例组11例样品OXTR-M和OXTR-U条带皆有扩增,4例仅有OXTR-U条带扩增,OXTR-M阳性率达到73%；正常对照组1例样品OXTR-M(?)口OXTR-U条带皆有扩增,其余14例样品仅有OXTR-U条带扩增,OXTR-U条带阳性率达到93%。通过高通量芯片技术已获得了甲状腺癌血DNA甲基化谱,并且通过实验室PCR技术验证了其中的一个有意义的高甲基化基因OXTR,它在甲状腺癌病例样本组中呈现较高的表达率。高甲基化基因是甲基化修饰异常的一种表现,可能与甲状腺癌的发生发展有关,有可能成为甲状腺癌血液诊断的分子标志物。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章 前言  12-20
  1.1 研究背景  12-13
    1.1.1 甲状腺癌的流行病学概况及诊断的局限性  12
    1.1.2 表观遗传与肿瘤的关系  12-13
  1.2 甲状腺癌DNA甲基化研究进展  13-18
    1.2.1 抑癌基因甲基化  13-15
    1.2.2 DNA修复基因甲基化  15-16
    1.2.3 肿瘤分子侵袭转移相关基因甲基化  16-17
    1.2.4 其他相关基因甲基化  17-18
  1.3 本研究目的与意义、研究内容、技术路线  18-20
    1.3.1 研究目的与意义  18-19
    1.3.2 研究内容  19
    1.3.3 技术路线  19-20
第二章 基于DNA甲基化芯片技术筛选人类甲状腺癌患者外周血高甲基化基因  20-43
  2.1 材料与方法  20-22
    2.1.1 研究对象  20
    2.1.2 试剂及仪器  20
    2.1.3 实验方法  20-22
  2.2 实验结果与分析  22-41
    2.2.1 研究对象  22-23
    2.2.2 甲基化芯片质量控制分析  23-24
    2.2.3 基因甲基化程度分析  24-26
    2.2.4 病例组和对照组全基因甲基化差异分析  26-37
    2.2.5 疾病预测诊断模型的构建  37-41
  2.3 讨论  41-43
第三章 基于MSP技术验证甲基化芯片结果  43-58
  3.1 材料与方法  43-49
    3.1.1 研究对象  43
    3.1.2 试剂及仪器  43-45
    3.1.3 实验方法  45-49
  3.2 实验结果与分析  49-55
    3.2.1 双链DNA的紫外吸收光谱图表  49-51
    3.2.2 基于RAA技术进行的MSP验证试验电泳结果  51-55
  3.3 讨论  55-58
第四章 结论  58-59
参考文献  59-62
附录1 甲基化芯片质量控制分析图集  62-66
附录2 疾病模型的准确度评估计算公式  66-67
硕士期间发表论文及参与主要科研工作  67-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 内分泌腺肿瘤 > 甲状腺肿瘤
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