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表达结核杆菌融合抗原的重组酿酒酵母免疫效果研究

作　者: 江佳稀
导　师: 刘建平
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 结核病疫苗重组酿酒酵母结核杆菌 Ag85B ESAT-6
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来结核病疫情严重,造成很大危害。疫苗是防治结核病最有效手段。卡介苗(BCG)是唯一得到批准并广泛使用的结核疫苗,但它的保护效果有限而且保护效果随着时间的增加而减弱。因此,开发研制更有效的结核疫苗十分迫切。目前正在研制的结核病疫苗主要有亚单位疫苗和活菌疫苗等,其中多个疫苗已进入临床试验阶段。近年出现了一种新的疫苗形式：重组酿酒酵母疫苗。重组酿酒酵母具有治疗性疫苗潜能,在防治丙型肝炎、结肠癌等传染病和肿瘤方面的应用研究取得了令人嘱目的进展。本研究以结核杆菌重要保护抗原Ag85B, ESAT-6为对象,利用本实验室具有自主知识产权的pHR酿酒酵母表达系统,分别构建了表达融合抗原Interferon-y-ESAT-6-Ag85B (IEA)和ESAT-6-Ag85B(EA)的重组酿酒酵母工程菌Y16/pHR-PAG-IEA (Yeast-IEA)和Y16/pHR-PAG-EA (Yeast-EA)。ELISA证实Yeast-IEA和Yeast-EA有效表达融合抗原IEA和EA。将热失活的重组酵母以皮下注射方式免疫C57/BL6小鼠,研究重组酿酒酵母免疫后对小鼠体液免疫、细胞免疫反应的影响，利用BCG攻击保护模型检测重组酵母疫苗对小鼠的保护作用。主要研究结果如下(1)表达结核杆菌抗原的重组酵母能够刺激小鼠产生Ag85B特异性抗体IgG,随着免疫次数增加IgG效价明显提高，4周时Yeast-IEA给小鼠IgG效价显著高于Yeast-EA组和BCG组小鼠,对照PBS组和酿酒酵母Y16组小鼠无Ag85B特异性抗体产生。而且随着免疫次数增加,不仅IgG2a、IgG1水平提高,而且IgG2a/IgG1比值也明显增加。免疫4周时Yeast-IEA组IgG2a/IgG1比值显著高于Yeast-EA组和BCG组小鼠。上述结果说明重组酿酒酵母免疫后能够有效刺激小鼠的体液免疫反应,相对于融合抗原EA和BCG,融合抗原IEA更有利于激发小鼠免疫系统Thl型反应。(2) ELISA检测结果显示重组酵母能够刺激小鼠产生IFN-γ、IL-2,对IL-4没有什么影响,其中Yeast-IEA免疫小鼠IFN-γIL-2显著高于Yeast-EA组和对照BCG组小鼠。与此对应地,流式细胞术检测结果显示Yeast-IEA组小鼠脾细胞中胞内产生IFN-γ或者IL-2的CD4+T淋巴细胞比例明显高于Yeast-EA组和对照BCG组小鼠。说明重组酵母能够刺激小鼠Th1型细胞免疫反应,与Yeast-EA相比,Yeast-IEA的刺激效果更强烈。(3)重组酵母能够刺激小鼠抗原递呈细胞--树突状细胞(dendritic cell)成熟分化。重组酵母免疫小鼠脾细胞中CD80、CD86、MHC I、MHCII阳性树突状细胞比例明显增加。体外实验也证实酵母与脾脏分离的树突状细胞直接接触作用,导致成熟树突状细胞比例大幅提升。(4)重组酵母免疫对小鼠感染分支杆菌BCG具有一定保护作用。小鼠经尾静脉大剂量注射BCG,与对照组相比,预先免疫了重组酵母的小鼠肺和脾脏部位感染的细菌数大幅度降低,说明重组酿酒酵母疫苗能够一定程度保护小鼠。上述研究结果表明,表达结核杆菌抗原的重组酿酒酵母皮下注射免疫可以激活小鼠体液免疫和细胞免疫系统,并能够降低分支杆菌感染效率。这些结果为其发展成为新型结核病防治疫苗奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-13
材料和方法  13-23
  1.材料  13-15
  2.实验方法  15-23
结果  23-37
  1.表达结核杆菌融合抗原的重组酿酒酵母构建与鉴定  23-26
  2.重组酿酒酵母免疫对小鼠体液免疫反应的影响  26-28
  3.重组酿酒酵母免疫对小鼠细胞免疫反应的影响  28-35
  4.重组酿酒酵母免疫保护作用研究  35-37
讨论  37-44
总结  44-45
参考文献  45-63
结核疫苗综述  63-71
  参考文献  65-71
研究成果及所获奖励  71-72
致谢  72-73

表达结核杆菌融合抗原的重组酿酒酵母免疫效果研究

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