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一类潜在的抗生素药物靶点蛋白NDH-2的结构与功能研究

作　者: 冯越
导　师: 杨茂君
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 电子传递链 NDH-2 药物靶点 Ndi1 C端结构域
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

电子传递链，又称呼吸链，由五个蛋白质复合物组成，是将代谢过程中产生的电子从NADH向氧分子传递的系统，是生物体最重要的能量来源。其中的复合物I，即NADH：泛醌氧化还原酶，是电子进入电子传递链的入口。在多种低等生物中，复合物I可以被一类称为二型NADH脱氢酶（NDH-2）的蛋白所取代。NDH-2附着在细胞膜或线粒体内膜上，以FAD为辅基，催化电子从NADH传递给泛醌（UQ）。NDH-2在疟原虫、结核杆菌等多种病原微生物中高度保守，而且已被证明是一类潜在的药物靶点。同时，在人体细胞中异源表达Ndi1蛋白（酿酒酵母的NDH-2），被认为可以作为一种基因治疗手段应用于复合物I缺陷引起的多种人类疾病，尤其是帕金森氏病等神经退行性疾病的治疗中。本文以NDH-2家族的典型代表——酿酒酵母的Ndi1蛋白为研究对象，解析了其高分辨率晶体结构及Ndi1与NADH、UQ以及NADH-UQ三种底物复合物的晶体结构。在所有晶体结构中，Ndi1均以同源二聚体的形式存在。结构分析和序列比对发现，Ndi1具有一个独特的并且在NDH-2家族中序列高度保守的C端结构域（CTD），该结构域介导了Ndi1二聚体化，进而使其形成一个广泛的疏水区域，该区域赋予了Ndi1附着在线粒体内膜上的能力。后续的生物化学和细胞生物学实验都证实了CTD对于Ndi1功能的重要性。同时，三种Ndi1-底物复合物结构的解析揭示了Ndi1与底物的结合方式，并证明了Ndi1中同时存在两个泛醌结合位点。电子顺磁共振实验的结果首次鉴定出在Ndi1介导的电子传递过程中有半醌自由基的出现，同时功率饱和实验支持有两个半醌自由基参与电子传递反应的理论。据此，本论文提出了Ndi1介导电子传递的模型。本文的研究成果为探讨NDH-2介导电子传递的详细机制、针对NDH-2的药物设计以及更好地将Ndi1应用于基因治疗奠定了良好的基础。本论文综合运用了结构生物学、生物化学与分子生物学、细胞生物学以及物理学等多个学科的实验方法系统地研究了NDH-2家族最具代表性的蛋白Ndi1的多方面特性，全方位地揭示了该蛋白发挥呼吸链电子传递入口这一重要生物学功能的机理。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
主要符号对照表  10-12
第1章引言  12-33
  1.1 本章引论  12
  1.2 能量工厂——电子传递链  12-13
    1.2.1 电子传递链简介  12-13
    1.2.2 电子传递链的组成  13
  1.3 NADH：泛醌氧化还原酶  13-17
    1.3.1 NADH：泛醌氧化还原酶的分类  13-16
    1.3.2 NADH：泛醌氧化还原酶的重要性  16-17
  1.4 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶  17-25
    1.4.1 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶简介  17
    1.4.2 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶的分类  17-19
    1.4.3 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶研究的起源  19
    1.4.4 原核生物的 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶  19-20
    1.4.5 真核生物的 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶  20-22
    1.4.6 关于人 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶是否存在的讨论  22-23
    1.4.7 已知 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶的生化特征  23-24
    1.4.8 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶与膜的相互作用  24-25
    1.4.9 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶的生理功能  25
  1.5 酿酒酵母 II 型 NADH：泛醌氧化还原酶——Ndi1  25-31
    1.5.1 Ndi1：潜在的抗生素药物靶点  26-27
    1.5.2 异源表达 Ndi1：未来的基因治疗手段  27-28
    1.5.3 Ndi1 研究中存在的若干问题  28-31
  1.6 本文研究工作的目的和意义  31
  1.7 本文各部分的主要内容  31-33
第2章实验材料与方法  33-53
  2.1 本章引论  33
  2.2 Ndi1 的表达与纯化  33-38
    2.2.1 载体及菌种  33-34
    2.2.2 试剂及仪器  34-35
    2.2.3 大肠杆菌表达质粒的构建与筛选  35
    2.2.4 蛋白的表达与纯化方法  35-38
  2.3 Ndi1 的结晶与结构解析  38-43
    2.3.1 试剂及仪器  38
    2.3.2 晶体初步筛选方法  38-39
    2.3.3 晶体优化方法  39-41
    2.3.4 获得晶体相位的方法  41
    2.3.5 晶体防冻液的配制  41-42
    2.3.6 晶体衍射数据收集、处理和结构解析  42-43
  2.4 系统进化关系的全基因组分析方法  43
  2.5 酵母功能实验  43-47
    2.5.1 载体及表达质粒的构建  43-44
    2.5.2 酵母培养基  44
    2.5.3 酵母菌种  44-45
    2.5.4 试剂及仪器  45
    2.5.5 酵母转化方法  45-46
    2.5.6 酵母生长检测方法  46
    2.5.7 酵母体内免疫共沉淀实验  46
    2.5.8 酵母膜组分分离实验  46-47
  2.6 Ndi1 蛋白的酶活检测  47
  2.7 电子顺磁共振实验  47-53
    2.7.1 仪器  47
    2.7.2 电子顺磁共振实验的原理  47-49
    2.7.3 自旋弛豫以及功率饱和现象  49-51
    2.7.4 电子顺磁共振实验检测半醌自由基  51
    2.7.5 功率饱和实验方法  51-53
第3章 Ndi1 蛋白的表达、纯化与结晶  53-63
  3.1 本章引论  53
  3.2 Ndi1 蛋白的纯化结果  53-55
  3.3 Ndi1 晶体的筛选与优化  55-61
    3.3.1 Ndi1 蛋白的结晶过程  55-59
    3.3.2 Ndi1 晶体的优化及防冻液选择  59-61
    3.3.3 Ndi1 蛋白-底物复合物的晶体生长  61
  3.4 本章小结与讨论  61-63
第4章 Ndi1 的晶体结构解析与生化特性研究  63-80
  4.1 本章引论  63
  4.2 Ndi1 的晶体数据收集与结构解析  63-65
  4.3 Ndi1 的生化特性研究  65-78
    4.3.1 Ndi1 的总体结构  66-68
    4.3.2 C 端结构域在 NDH-2 中高度保守  68-69
    4.3.3 Ndi1 以二聚体的形式存在  69-75
    4.3.4 Ndi1 依靠 CTD 附着在线粒体内膜上  75-78
  4.4 本章小结与讨论  78-80
第5章 Ndi1 介导的电子传递机制分析  80-100
  5.1 本章引论  80-81
  5.2 Ndi1 与 FAD、NADH、UQ 的结合  81-89
    5.2.1 FAD 在 Ndi1 中的结合方式  81
    5.2.2 NADH 在 Ndi1 中的结合方式  81-84
    5.2.3 UQ 在 Ndi1 中的结合方式  84-89
  5.3 Ndi1 介导的电子传递机制分析  89-97
    5.3.1 Ndi1-NADH-UQ 复合物的晶体结构  89-90
    5.3.2 Ndi1 介导的电子传递过程中存在半醌自由基  90-93
    5.3.3 Ndi1 介导的电子传递涉及两个半醌自由基  93-97
  5.4 本章小结与讨论  97-100
    5.4.1 UQII可以接受还原型 FAD 的电子  97-98
    5.4.2 Ndi1 的电子传递机制细节  98-99
    5.4.3 Ndi1 与底物分子反应的动力学机制  99-100
第6章结论  100-103
  6.1 C 端结构域对 Ndi1 至关重要  100
  6.2 Ndi1 介导的电子传递机制  100-101
  6.3 尚待解决的问题及以后的研究方向  101-103
参考文献  103-113
致谢  113-115
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  115

一类潜在的抗生素药物靶点蛋白NDH-2的结构与功能研究

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