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结核分枝杆菌中参与胆固醇降解的CYP450酶催化体系的功能研究

作　者: 乔峰
导　师: 游雪甫
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 结核分枝杆菌 细胞色素P450酶 电子传递链 铁氧还蛋白还原酶 铁氧还蛋白
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


结核病至今仍为严重的传染病,每年的致死率仍高居传染病杀手第二位。特别是近年来,耐多药结核分枝杆菌和泛耐药结核分枝杆菌的出现及传播,对临床上现用抗生素的有效治疗带来严峻挑战,给人们的健康造成极大的隐患,因此我们急需寻找新型抗结核作用靶标,以筛选新型抗结核药物。研究发现,结核分枝杆菌基因组编码20种细胞色素P450酶,这些P450酶在细菌体内均发挥着着至关重要的生理功能。以CYP125A1和CYP142A1为例,因在胆固醇的降解与利用中发挥重要的作用,被认为是潜在的抗结核作用靶标。然而,在P450酶催化体系中介导CYP125A1和CYP124A1电子传递的电子传递链蛋白至今仍未阐明。本论文主要目的是对结核分枝杆菌细胞色素P450酶的电子传递链蛋白进行深入研究,并对参与胆固醇降解的P450酶的电子传递链进行预测及分析。我们首先采用大肠埃希菌作为宿主,克隆结核分枝杆菌H37Rv基因组中所有P450酶的电子传递链蛋白的编码基因从而进行外源性表达,包括铁氧还蛋白还原酶 的学位论文">铁氧还蛋白还原酶(FDR)、所有铁氧还蛋白(FDX)和4种P450酶,并从耻垢分枝杆菌中分离出7Fe-8S铁氧还蛋白MSFdxA;然后以2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)或细胞色素C为电子受体评价FDR对NADH和NADPH的氧化活性以及FDR与不同FDX的偶联作用；最后我们采用HPLC分析P450酶对4-胆甾烯-3-酮的代谢作用,进而研究P450酶催化体系中电子传递链蛋白与P450酶之间的关系,以期发现结核分枝杆菌中参与胆固醇降解的P450酶的电子传递链蛋白。本研究成功表达了3个FDR (FdrA、FprA和FdxB的铁氧还蛋白还原酶结构域)、3个FDX(Fdx、FdxD和Rv1786)和4个P450酶(CYP125A1、CYP124A1、CYP142A1和CYP143A1),从耻垢分枝杆菌中分离出MSFdxA替代FdxA、FdxC和FprBX进行研究,获得了结核分枝杆菌P450酶电子传递链蛋白的所有类型组分；系统比较分析了3个FDR对NADH(?)口NADPH的氧化活性以及这3个FDR与6个FDX的偶联情况；建立了相应的HPLC方法分析参与胆固醇降解P450酶的电子传递链。研究表明,与FdrA偶联作用最强的铁氧还蛋白是FdxD和Rv1786,与FprA(?)禺联作用最强的是Fdx和MSFdxA, spFDX次之；FprA可以作为参与胆固醇降解P450酶的电子传递链的FDR组分,FdrA不是参与胆固醇降解P450酶的电子传递链的FDR组分,spFDX、MSFdxA和FdxD可以作为参与胆固醇降解P450酶的电子传递链的FDX组分,spFDX对CYP125A1和CYP142A1电子传递作用较强,MSFdxA(?)寸CYP124A1电子传递作用较强,Fdx、Rv1786不是参与胆固醇降解P450酶的电子传递链的FDX组分。因此我们推测FprA/FdxA、FprA/FdxC和(或)FprB可能是结核分枝杆菌中参与胆固醇降解P450酶的电子传递链,进一步明确了参与胆固醇降解P450酶的电子传递机制,并为建立以参与胆固醇降解P450酶催化体系作为药物靶标提供依据。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-12
材料与方法  12-30
  一、试验材料  12-16
  二、研究方法  16-30
实验结果  30-66
  一、铁氧还蛋白还原酶 的学位论文">铁氧还蛋白还原酶对NADH和NADPH的氧化活性的分析  30-37
  二、结核分枝杆菌铁氧还蛋白与铁氧还蛋白还原酶的偶联作用分析  37-48
  三、结核分枝杆菌细胞色素P450酶的外源表达及鉴定  48-56
  四、体外分析参与胆固醇降解P450酶的电子传递链  56-63
  五、CYP143A1的活性摸索  63-66
讨论  66-75
  一、铁氧还蛋白还原酶对NADH和NADPH的氧化活性的分析  66-68
  二、结核分枝杆菌铁氧还蛋白与铁氧还蛋白还原酶的偶联作用分析  68-71
  三、结核分枝杆菌细胞色素P450酶的电子传递链分析  71-74
  四、CYP143A1的活性分析  74-75
结论与展望  75-77
  一、结论  75-76
  二、展望  76-77
参考文献  77-80
文献综述  80-93
  参考文献  89-93
发表文章  93-94
致谢  94-95
附录  95-119

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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