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肺炎链球菌LicC蛋白在致病过程中作用的研究

作　者: 曾宪飞
导　师: 郝晓柯；马越云
学　校: 第四军医大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺炎链球菌 licC基因磷酸化胆碱药物靶点 dprA基因
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肺炎链球菌普遍定植于呼吸道,是人类重要的侵袭性病原菌之一,是社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、鼻窦炎的主要病原菌,其引起的脑膜炎和菌血症死亡率高。肺炎链球菌主要感染2岁以下幼儿及65岁以上老年人,是全球范围内导致儿童死亡的最重要原因之一。另一方面,自上世纪60年代中期发现第一株对青霉素耐药的肺炎链球菌(PRSP)以来,耐药状况发展迅速,分离率明显上升,在一些国家和地区,PRSP已高达40%～50%。并且,多重耐药现象严重,PRSP菌株中,有60%～90%同时对氯霉素、克林霉素、磺胺甲基异恶唑、红霉素、四环素耐药。随着近年来肺炎链球菌耐药性的不断增强和有效疫苗的缺乏,新的治疗靶点的发现变得越来越重要,肺炎链球菌致病相关基因愈来愈受到关注和重视。我们在前期研究中采用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis, STM)构建了肺炎链球菌突变体文库,筛选到了一个新的肺炎链球菌致病相关基因licC (CTP:Phosphocholine Cytidylyltransferase)。它是核苷转移酶家族的独特成员,编码磷酸化胆碱胞苷酰转移酶(CTP:phosphocholine cytidylyltransferase,CCT),负责生成二磷酸胞嘧啶胆碱(CDP-Cho),是合成磷酸化胆碱(phosphocholine,PCho)的关键酶之一。研究表明,胆碱代谢在肺炎链球菌的细胞分裂、转化、自溶和致病过程中具有重要作用,PCho不仅本身就是一个毒力因子,与其结合在一起的胆碱结合蛋白更是肺炎链球菌黏附和侵袭必不可少的因素。前期实验中,我们建立了STM插入突变株,插入点位于licC 3’端78bp处,实验表明,licC基因的突变可使细菌毒力显著减弱、生长严重受抑,并且与多种毒力因子相关联。同时,licC在肺炎链球菌中极为保守,与其他真核和原核细胞相应基因缺乏同源性,是一个理想的药物靶点,在研究新型抗肺炎链球菌药物方面具有良好前景。在此基础上,本研究将进一步探讨STM插入突变株在生物学特性和毒力方面发生变化的原因,寻找LicC的重要功能位点,研究该基因在肺炎链球菌生长和致病过程中的作用,并构建licC低表达菌株,为针对licC的药物筛选打下基础。本实验构建了重组质粒pQE80-licC、pQE80-?licC,包含了licC的全序列和licC截短体(?licC)。其中?licC为3’端78bp缺失的licC序列,与STM插入突变株中licC的缺失部分一致。可溶性分析表明,E.coli BL21成功表达目的蛋白, LicC及?LicC均在上清中有表达,并通过亲和层析获得纯化蛋白。实验中,自行建立了生物发光技术,用以测定表达蛋白的酶活性,结果显示?licC的活性仅相当于全序列蛋白的6%,证实缺失区域与酶活性密切相关。由于缺失部分包含了与Mg2+结合的Glu216,我们推测活性减低与缺失了该谷氨酸关系密切;从而解释了STM突变株生长减慢、毒性减低的原因,证实缺失区域是LicC重要的功能位点之一。构建licC缺失突变株并进行一系列相关功能试验是研究LicC在肺炎链球菌致病过程中作用的重要方法。我们拟采用构建多个突变子(上游同源臂+筛选标记序列+下游同源臂)转化肺炎链球菌、通过同源重组的方法获得licC缺失突变株。但是,即使构建的6个突变子覆盖了licC不同长度的缺失基因,不同长度的上、下游同源臂及不同的抗生素筛选标记基因;同时,设置肺炎链球菌转化阳性对照对转化过程进行质量控制的情况下,仍然未能获得licC缺失突变株。即使得到了一株下游同源臂发生同源重组的突变株,但该突变株中,licC仍是完整基因(licC的缺失突变由上游同源臂引发);而同源重组构建策略已证明是构建肺炎链球菌突变株简便、高效、成熟的方案,在大量研究中均得到运用;于是,结合文献,我们认为licC是肺炎链球菌的必需基因,同样证实了将licC作为药物靶点的可行性。在构建licC缺失突变株过程中,仍然获得了一株下游同源臂发生同源重组而将抗生素筛选标记序列整合入基因组的突变株。我们推测,出现该突变株的原因可能有:①下游同源臂发生预期的同源重组,导致突变子的一端嵌入基因组。②licC是必需基因,难以由缺失的licC序列的上游同源臂替换licC全序列而发生预期的同源重组。③抗生素压力下,将抗生素筛选标记序列整合入基因组。经测序证实,虽然licC未发生缺失突变,但licC的下游基因dprA发生了插入突变。相关实验证实该突变株黏附能力下降(仅相当于标准株的约30%)、疏水性发生改变、约100KD的胆碱结合蛋白缺失,从而首次证实dprA与肺炎链球菌毒力相关,具体机制仍有待研究。由于dprA是肺炎链球菌自然转化的必需基因,本实验结果为将肺炎链球菌的自然转化和毒力进行联合研究打开了思路。反义RNA(Antisense RNA,ASRNA)作为有效抑制目的基因表达的手段已为大家所公认。本实验通过该方法构建了LicC低表达株。实验中设计了3条反义RNA,分别代表了不同的长度,即licC基因5’端321bp、506bp、708bp片段,利于从中挑选出抑制效果较好的ASRNA。以抗LicC抗体为一抗的western blot表明,3条ASRNA均有一定程度的抑制作用,成功构建了licC低表达株。该低表达菌株的获得弥补了未能建立licC缺失突变株的缺憾,对licC在生物学特性、致病力等方面的研究具有重要意义,并且为针对LicC的全细胞药物筛选奠定了基础。综上所述,本研究成功阐释了STM插入突变株在生长和毒力方面发生变化的原因,证实了3’端78bp是licC的重要功能位点;针对licC进行同源重组构建突变株的失败反向证实了licC是肺炎链球菌的必需基因,为针对LicC的新型药物筛选打下了理论基础;并构建了licC低表达菌株,对licC的功能研究和药物筛选具有重要意义。本实验还意外地获得了dprA突变株,并首次证实了dprA在肺炎链球菌毒力中的作用,提示抑制单个基因就可能达到同时抑制肺炎链球菌自然转化和毒力的效应。

全文目录

缩略语表  8-12
中文摘要  12-16
ABSTRACT  16-21
前言  21-23
文献回顾  23-33
正文  33-122
  实验一 LicC及LicC截短体基因的克隆及表达载体的构建  33-53
    1 材料  33-36
      1.1 菌株  33
      1.2 质粒载体  33
      1.3 主要试剂  33-34
      1.4 常用缓冲液及培养基  34-35
      1.5 主要仪器  35-36
    2 方法  36-44
      2.1 引物设计  36
      2.2 CTAB法提取肺炎链球菌总DNA  36-37
      2.3 PCR扩增licC全长及?licC序列  37-39
      2.4 E.coli DH5α感受态细胞的制备  39
      2.5 构建重组表达质粒pQE80-licC及pQE80-ΔlicC  39-44
    3 结果  44-51
      3.1 PCR获得目的片段licC、?licC  44-45
      3.2 重组质粒的鉴定  45-51
    4 讨论  51-53
  实验二肺炎链球菌LicC及?LicC的表达及活性测定  53-72
    1 材料  53-57
      1.1 表达菌株  53
      1.2 表达载体  53
      1.3 主要试剂  53-54
      1.4 常用缓冲液及培养基  54-57
      1.5 主要仪器  57
    2 方法  57-64
      2.1 重组质粒转化E.coli BL21  57-59
      2.2 LicC、?LicC诱导表达和可溶性分析  59-60
      2.3 目的蛋白的纯化及浓度测定  60-62
      2.4 western blot 鉴定表达蛋白  62-63
      2.5 LicC、?LicC的活性分析  63-64
    3 结果  64-69
      3.1 目的蛋白诱导表达与表达条件优化  64-65
      3.2 表达蛋白的可溶性分析及纯化  65-66
      3.3 western blot鉴定表达蛋白  66-67
      3.4 CCT活性分析  67-69
    4 讨论  69-72
  实验三 LicC缺失突变株的构建及相关功能实验  72-111
    1 材料  72-76
      1.1 菌株  72
      1.2 载体  72
      1.3 细胞株  72
      1.4 主要试剂  72-73
      1.5 常用缓冲液及培养基  73-75
      1.6 主要仪器  75-76
    2 方法  76-91
      2.1 LicC缺失突变株的构建  76-89
      2.2 ?R6 与R6 生长曲线测定  89
      2.3 黏附实验  89-90
      2.4 疏水性分析  90-91
      2.5 胆碱结合蛋白的分析  91
    3 结果  91-108
      3.1 PCR扩增构建突变株的DNA片段  91-94
      3.2 连接片段U794-Janus的扩增  94
      3.3 重组质粒pGEM-T-U794-Janus的酶切鉴定  94-95
      3.4 重组质粒pGEM-T-U794-Janus-D622 的酶切鉴定  95-97
      3.5 PCR扩增获得突变子U794-Janus-D622  97
      3.6 酶切鉴定构建各突变子的重组质粒  97-99
      3.7 扩增突变子  99-101
      3.8 ?R6 的PCR鉴定  101-102
      3.9 ?R6 的测序鉴定  102-106
      3.10 生长曲线测定  106
      3.11 黏附实验  106-107
      3.12 疏水性分析  107
      3.13 胆碱结合蛋白分析  107-108
    4 讨论  108-111
  实验四构建LicC低表达菌株  111-122
    1 材料  111-114
      1.1 菌株  111
      1.2 质粒载体  111
      1.3 主要试剂  111-112
      1.4 常用缓冲液及培养基  112-113
      1.5 主要仪器  113-114
    2 方法  114-118
      2.1 引物设计  114
      2.2 CTAB法提取肺炎链球菌总DNA  114
      2.3 PCR扩增构建LicC低表达株的序列  114-115
      2.4 构建重组质粒pDL278-ASRNA  115-118
      2.5 构建LicC低表达菌株  118
      2.6 LicC低表达菌株的鉴定  118
    3 结果  118-121
      3.1 PCR扩增目的片段  118-119
      3.2 重组质粒的鉴定  119-120
      3.3 Western blot鉴定licC低表达菌株  120-121
    4 讨论  121-122
小结  122-123
参考文献  123-132
个人简历和研究成果  132-133
致谢  133

肺炎链球菌LicC蛋白在致病过程中作用的研究

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