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人类Smad7的N端结构域（NTD）蛋白质的折叠性质研究

作　者: 周静
导　师: 吴更
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Smad7 抑制型Smad Smad7的N端结构域 TGF-β信号通路蛋白质折叠性质
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Smad7是一种重要的抑制型Smad蛋白,它主要通过竞争受体调控型Smad与细胞膜上I型TGF-β受体之间的结合,来调节TGF-β受体的泛素化和降解,对TGF-β信号通路起负调节作用。Smad7的N端结构域(NTD)在介导Smad7与E3泛素连接酶Smurf2和E2泛素结合酶UbcH7的相互作用过程中起关键作用,但是我们对它的生物化学和结构生物学特性知之甚少。本论文首先采用生物信息学方法对人类Smad7氨基酸序列的折叠倾向性进行分析,并且结合二级结构预测和多物种间抑制型Smad序列对比得到预测的Smad7-NTD蛋白的性质特征。然后我们构建一系列删除不同长度N端序列和中间预测Loop序列的重组蛋白,对这些蛋白进行生物化学特性分析。结果显示:Smad7的N端前20个左右的氨基酸影响Smad7-NTD蛋白的可溶性,它的删除会造成蛋白质不溶或聚集,因此推测这些氨基酸残基在蛋白质折叠中有非常重要的作用。同时由生物信息和生物化学实验的结果可以看出,Smad7-NTD的N端存在一个不参与折叠的无规Loop结构,这个Loop的存在导致Smad7-NTD蛋白易降解,而删除这段Loop可以提高蛋白质的稳定性,使蛋白更适用于后期结晶实验的研究。同时本论文对另一种抑制型Smad蛋白Smad6进行了生物信息学分析,发现其结构预测与Smad7相似,但是对其蛋白质的性质还有待进一步研究。同时也对序列与其他R-Smad高度同源,但是功能却不一样的Smad2-MH1结构域进行了纯化与初步结晶研究,表达了删除部分氨基酸残基且性质稳定、可用来做结晶的Smad2-MH1重组蛋白。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
缩略词表  13-14
第1章绪论  14-22
  1.1 TGF‐β信号通路的研究背景  14
  1.2 TGF‐β信号的传导  14-16
  1.3 TGF‐β信号通路的Smad 蛋白家族  16-17
  1.4 抑制型Smad 蛋白研究进展  17
  1.5 Smad7‐NTD 的作用以及研究现状  17-19
  1.6 生物信息学的意义及其应用  19-20
  1.7 结构生物学及其研究目的  20
  1.8 本实验的研究内容和意义  20-22
第2章材料与方法  22-40
  2.1 主要仪器  22-23
  2.2 材料  23-26
    2.2.1 菌株  23
    2.2.2 质粒  23-24
    2.2.3 引物  24-26
    2.2.4 主要的酶及试剂  26
  2.3 主要试剂的配制  26-29
    2.3.1 培养基和使用化学试剂的配制  26-28
    2.3.2 亲和层析、凝胶过滤的缓冲液  28-29
    2.3.3 抗生素及其使用浓度  29
  2.4 主要实验方法  29-40
    2.4.1 引物设计、合成、准备  29-30
    2.4.2 PCR 扩增目标片段  30-31
    2.4.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳  31
    2.4.4 凝胶回收  31-32
    2.4.5 限制性内切酶切割  32-33
    2.4.6 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳及回收  33
    2.4.7 片段与载体的连接  33
    2.4.8 转化感受态细胞  33-34
    2.4.9 小规模质粒提取  34-35
    2.4.10 蛋白质表达测试及纯化  35-36
    2.4.11 蛋白质大规模表达纯化  36-37
    2.4.12 蛋白质离子交换层析纯化  37
    2.4.13 蛋白质浓缩  37-38
    2.4.14 凝胶过滤纯化蛋白  38-39
    2.4.15 Smad7‐NTD 蛋白降解实验  39-40
第3章 HumanSmad7‐NTD 生物信息学分析  40-46
  3.1 前言  40-41
  3.2 实验结果  41-45
    3.2.1 FoldIndex 蛋白折叠倾向性预测  41-42
    3.2.2 NPP 蛋白折叠倾向性预测  42-43
    3.2.3 PredictProtein 蛋白二级结构预测  43-44
    3.2.4 I‐Smads 蛋白序列对比  44-45
  3.3 本章小结  45-46
第4章 Smad7 的 N 端约20 个氨基酸残基对其蛋白可溶性有重要影响  46-52
  4.1 前言  46
  4.2 实验结果  46-51
  4.3 本章小结  51-52
第5章 Smad7‐NTD 中预测 Loop 结构对蛋白质性质的影响  52-65
  5.1 前言  52-53
  5.2 实验结果  53-63
    5.2.1 删除Loop 区域重组蛋白的构建和亲和层析纯化  53-58
    5.2.2 降解实验  58-61
    5.2.3 凝胶过滤色谱检查蛋白质状态  61-63
  5.3 本章小结  63-65
第6章 Smad6‐NTD 生物信息学分析  65-69
  6.1 前言  65
  6.2 实验结果  65-68
    6.2.1 FoldIndex 蛋白折叠倾向性预测  65-66
    6.2.2 NPP 蛋白折叠倾向性预测  66-67
    6.2.3 PredictProtein 蛋白二级结构预测  67-68
    6.2.4 I‐Smads 蛋白序列对比  68
  6.3 本章小结  68-69
第7章 Smad2‐MH1 结构生物学研究  69-77
  7.1 前言  69-70
  7.2 实验结果  70-76
    7.2.1 Smad 蛋白序列比对  70-71
    7.2.2 Smad21‐172Δ21‐30 的构建  71-72
    7.2.3 蛋白质的表达纯化  72-76
    7.2.4 His‐Smad21‐172Δ21‐30 晶体条件研究  76
  7.3 本章小结  76-77
第8章总结与展望  77-79
  8.1 总结  77-78
  8.2 展望  78-79
参考文献  79-82
附录I  82-85
附录II  85-88
附录III  88-92
致谢  92-93
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人类Smad7的N端结构域（NTD）蛋白质的折叠性质研究

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