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Aspergillus ficuum菊粉酶的基因克隆、表达及其结构与功能研究

作　者: 陈晓明
导　师: 金征宇
学　校: 江南大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 无花果曲霉 内切菊粉酶 外切菊粉酶 基因克隆 大肠杆菌 定点突变 活性中心 C 端结构域 功能
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


菊粉酶专一性水解β-2,1-D-呋喃果糖苷键，按其作用方式不同分为内切和外切两类。内切菊粉酶（endoinulinase, EC3.2.1.7）从菊粉链内部随机地切断糖苷键，降解产物主要为菊粉型低聚果糖。外切菊粉酶（exoinulinase, EC3.2.1.80）则从菊粉链的果糖末端逐个地水解糖苷键，产物主要为果糖。菊粉酶广泛存在于各种微生物中，在饲料、食品、医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。本实验室从土壤中成功筛选到一株产菊粉酶的菌株Aspergillus ficuum JNSP5-06，此菌株可以产内切菊粉酶（endo I）和外切菊粉酶（exo I），且产酶性能稳定。为了进一步提高酶活力，探讨菊粉酶作用机制，本研究运用分子生物学的方法，克隆和表达了内、外切菊粉酶的基因，并在此基础上，通过定向诱变技术研究了内切菊粉酶的催化活性中心和菊粉酶分子的C端结构域的作用。根据Genbank中记录的菊粉酶基因序列信息，利用PCR技术从Aspergillus ficuum JNSP5-06基因组中扩增和克隆了相关基因片段，获得了endo I的DNA和exo I的DNA、cDNA序列，克隆的endo I和exo I的DNA序列在Genbank中的登录号分别为FJ984582和HM587130。序列分析可知：内切菊粉酶endo I的DNA序列全长1658bp，包含了蛋白质编码区1482bp，3′非编码区176bp；内切酶由493个氨基酸组成，理论分子量Mw为53.2kDa，等电点pI为4.33。外切菊粉酶exo I的DNA序列全长1674bp，包含信号肽编码区57bp，蛋白质编码区1557bp，内含子编码区60bp；exoI全长537个氨基酸，其中信号肽和成熟肽分别由19和518个氨基酸残基组成；其理论分子量Mw为57.2kDa，等电点pI为4.89。将内、外切菊粉酶成熟肽的编码序列分别插入到大肠杆菌表达载体pET-28a（+）中，构建重组质粒pET28a（+）-endo I和pET28a（+）-exo I，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得基因工程重组菌JPE21/endo I和JPE21/exo I。对菌株的IPTG诱导表达条件优化结果发现：JPE21/endo I在OD600为0.308左右时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，23℃诱导6h，酶活最高达22.36u/mg；JPE21/exo I则在OD600为0.402左右时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，26℃诱导7h，其酶活可达59.24u/mg。经SDS-PAGE检测，重组内、外切菊粉酶的分子量分别约为59kDa、63kDa。对其酶学性质的研究结果表明：（1）重组内切菊粉酶的最适pH为5.0，最适反应温度为55℃。Ag+和Cu2+能完全抑制酶的活性，Fe2+、Fe3+和Al3+对酶有较强的抑制作用，而Zn2+、Mn2+、K+对酶有激活作用。在pH5.0、55℃条件下，内切酶水解菊粉的Km和kcat分别为（8.9±1.5）mM和（1.38±0.12）×103min-1。（2）重组外切菊粉酶作用于菊粉和蔗糖的最适pH值分别为4.0和5.0；最适温度分别为60℃和55℃。金属离子对其活力的影响与底物相关，Cu2+完全抑制外切酶对菊粉的作用，而对蔗糖保持10%的活性；Ag+使酶对菊粉和蔗糖的活力分别降低了45.6%和82.9%；Mg2+、Zn2+、Fe2+、Al3+、Ni2+对酶有较强的抑制作用，而Mn2+对酶有激活作用。在pH5.0、55℃条件下，外切酶水解菊粉Km和kcat分别为（7.1±0.2）mM和（6.1±0.0）×104min-1，水解蔗糖的Km和kcat分别为（347.6±25.9）mM和（7.34±0.49）×105min-1。通过酶活测定以及酶解产物的薄层层析和液相色谱分析，发现重组内切菊粉酶仅专一性水解菊粉，产物主要为低聚二糖、三糖、四糖；外切菊粉酶不仅能水解菊粉，还能降解蔗糖，另外在高浓度的蔗糖中，还有微弱的转果糖基作用。对内切菊粉酶endo I进行同源建模和序列比较，定点突变证明内切菊粉酶催化位点的关键氨基酸残基为Glu-20及Glu-210，底物结合位点的关键氨基酸残基为Asp-153。利用PCR和overlap-PCR技术使得内、外切菊粉酶的C端结构域发生缺失和交换突变，结果发现突变酶的活性急剧下降，且内切突变酶对蔗糖产生降解作用，推测C端结构域起到识别底物、稳定酶分子空间结构、保持酶催化活性的作用。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-11
第一章 绪论  11-22
  1.1 概述  11-12
  1.2 微生物菊粉酶的生产  12
  1.3 菊粉酶的酶学性质  12-16
    1.3.1 菊粉酶的专一性  13
    1.3.2 菊粉酶的分子量  13-14
    1.3.3 温度和 pH 对酶活性和稳定性的影响  14-16
    1.3.4 酶反应动力学  16
  1.4 菊粉酶的催化机制  16
  1.5 菊粉酶的分子生物学特性  16-20
  1.6 菊粉酶分子结构的研究进展  20-21
  1.7 本课题的立题背景和意义  21
  1.8 本论文的主要研究内容  21-22
第二章 Aspergillus ficuum 菊粉酶基因的克隆及序列分析  22-36
  2.1 前言  22
  2.2 材料与方法  22-27
    2.2.1 菌株与质粒  22-23
    2.2.2 酶与药品、试剂盒  23
    2.2.3 主要仪器  23
    2.2.4 培养基与培养条件  23
    2.2.5 试剂配制  23-24
    2.2.6 无花果曲霉总 DNA 的提取  24
    2.2.7 菊粉酶基因序列的 PCR 扩增  24-25
    2.2.8 目的片段的纯化与回收  25-26
    2.2.9 PCR 产物的 TA 克隆  26
    2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  26
    2.2.11 大肠杆菌重组质粒的提取  26-27
    2.2.12 菊粉酶基因序列测定及序列分析  27
  2.3 结果与分析  27-35
    2.3.1 无花果曲霉总 DNA 的提取  27
    2.3.2 菊粉酶基因序列的 PCR 扩增和克隆  27-29
    2.3.3 菊粉酶 endo I 和 exo I 的序列分析  29-32
    2.3.4 Aspergillus ficuum JNSP5-06 菊粉酶与其它菊粉酶一级结构的同源性比较  32-34
    2.3.5 Aspergillus ficuum JNSP5-06 菊粉酶的系统进化树分析  34
    2.3.6 Aspergillus ficuum JNSP5-06 菊粉酶二级结构分析及三维结构建模  34-35
  2.4 本章小结  35-36
第三章 Aspergillus ficuum 菊粉酶基因在大肠杆菌中的表达  36-48
  3.1 前言  36
  3.2 材料与方法  36-39
    3.2.1 菌株与质粒  36
    3.2.2 酶与药品、试剂盒  36-37
    3.2.3 主要仪器  37
    3.2.4 培养基与培养条件  37
    3.2.5 试剂配制  37-38
    3.2.6 大肠杆菌表达载体的构建  38
    3.2.7 目的基因与 pET-28a(+)质粒连接  38
    3.2.8 表达重组质粒转化大肠杆菌  38
    3.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定  38
    3.2.10 重组菌的诱导表达  38
    3.2.11 重组粗酶液的提取  38
    3.2.12 大肠杆菌表达产物的分析  38-39
  3.3 结果与分析  39-47
    3.3.1 菊粉酶大肠杆菌表达载体的构建  39-40
    3.3.2 菊粉酶表达载体在大肠杆菌中的表达  40-43
    3.3.3 内、外切菊粉酶表达量差异的影响因素分析  43-44
    3.3.4 菊粉酶在大肠杆菌中表达条件的优化  44-47
  3.4 本章小结  47-48
第四章 Aspergillus ficuum 大肠杆菌重组菊粉酶的酶学性质  48-63
  4.1 前言  48
  4.2 材料与方法  48-50
    4.2.1 实验菌株  48
    4.2.2 主要试剂  48
    4.2.3 主要仪器  48
    4.2.4 培养基与培养条件  48
    4.2.5 菊粉酶活力测定方法  48
    4.2.6 大肠杆菌重组菊粉酶的纯化  48-49
    4.2.7 重组菊粉酶的分子量测定  49
    4.2.8 酶学性质的测定  49-50
    4.2.9 重组菊粉酶的水解产物分析  50
  4.3 结果与讨论  50-62
    4.3.1 大肠杆菌重组菊粉酶的纯化  50-52
    4.3.2 纯化酶的纯度鉴定和相对分子质量的测定  52-53
    4.3.3 酶学性质的测定  53-59
    4.3.4 重组菊粉酶的水解产物分析  59-62
    4.3.5 酶学性质的比较与分析  62
  4.4 本章小结  62-63
第五章 Aspergillus ficuum 内切菊粉酶催化残基的定点突变  63-73
  5.1 前言  63
  5.2 材料与方法  63-66
    5.2.1 菌株与质粒  63
    5.2.2 酶、药品与培养基  63
    5.2.3 主要仪器  63-64
    5.2.4 同源建模与结构预测  64
    5.2.5 一步法质粒 PCR 定向诱变法  64-65
    5.2.6 突变重组内切菊粉酶的诱导表达  65
    5.2.7 突变重组内切菊粉酶的纯化  65
    5.2.8 蛋白质免疫印迹  65-66
    5.2.9 突变重组内切菊粉酶活力检测  66
    5.2.10 突变重组内切酶的酶学性质  66
  5.3 结果与分析  66-72
    5.3.1 endo I 同源建模及目标模型的评价  66-68
    5.3.2 催化残基及相关位点的确定  68
    5.3.3 催化残基的定向诱变  68-69
    5.3.4 突变重组内切菊粉酶的表达  69-70
    5.3.5 突变对内切菊粉酶活性的影响  70-72
  5.4 本章小结  72-73
第六章 Aspergillus ficuum 菊粉酶 C 端结构域的功能研究  73-82
  6.1 前言  73
  6.2 材料与方法  73-76
    6.2.1 菌株与质粒  73
    6.2.2 酶与药品、试剂盒  73-74
    6.2.3 主要仪器  74
    6.2.4 培养基与培养条件  74
    6.2.5 定向突变方法  74-75
    6.2.6 重组表达载体的构建、筛选与鉴定  75
    6.2.7 突变重组酶的诱导表达  75
    6.2.8 蛋白质免疫印迹  75-76
    6.2.9 突变重组酶活力检测  76
  6.3 结果与分析  76-81
    6.3.1 定向突变方案的确定  76-77
    6.3.2 菊粉酶基因 C 端缺失的定向突变  77-78
    6.3.3 菊粉酶基因 C 端交换的定向突变  78-80
    6.3.4 C 端突变重组酶的表达  80-81
    6.3.5 C 端突变对菊粉酶活性的影响  81
  6.4 本章小结  81-82
论文主要结论与展望  82-84
论文创新点  84-85
致谢  85-86
参考文献  86-95
附录  95-97

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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