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难治性急性髓系白血病特异调控通路的初步研究

作　者: 尹曦
导　师: 郑文岭
学　校: 南方医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 难治急性髓系白血病差异表达基因调控通路药物靶点
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的：急性白血病按细胞形态学、细胞化学染色可分为急性淋巴系白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)两大类。急性髓系白血病是一种骨髓性造血细胞异常增殖的血液恶性肿瘤。其特点是骨髓内的髓细胞异常增生,且分化不完全,导致造血功能异常(如粒细胞减少、血小板减少,或贫血),并伴有白细胞增多。AML是成年人最常见的急性白血病,其发病率随着人的年龄而增加。由于骨髓的白细胞浸润和由此导致的血细胞减少,AML病人会感到疲劳、出血,或感染和发烧。一般按照FAB分类法(FAB Classification)将AML分为9个不同的亚型：M0、M1-7和M4Eo。另一种分类方法是世界卫生组织分类法(WHO classification),原则上仍比照FAB分类法,但是加入了对细胞遗传性状的考察。AML-M2约占AML的25-30%,它在各个年龄段出现,其中20%的病人在25岁以下,而40%的病人大于60岁。在1986年我国天津召开的白血病分类分型讨论会上,M2被细分为M2a和M2b两种亚型。白血病的成因十分复杂,目前已确定的病因有如下几个：放射,病毒,化学物质,药物,遗传易感性以及某些血液病等等。遗传与白血病的关系不容小觑,某些少见的先天性染色体异常患者继发急性白血病的危险明显增加,如唐氏综合症、Fanconi贫血、Blom综合症和多发性神经纤维瘤发生AML和ALL的机会均较高。影响AML预后的因素包括细胞遗传学、年龄、白细胞数、乳酸脱氢酶水平、表观遗传学、既往血液病病史、既往化疗史、达完全缓解的时间等等。其中,细胞遗传学对AML预后的影响已成为公认的事实,对预测治疗反应和持续缓解时间具有独立的预后价值。关于AML预后因素的研究已有大量报道,而新的研究也源源不断的给予补充。对于白血病的治疗最主要采用的是联合化疗、造血干细胞移植等方法。经治疗,有的白血病人可以达到完全缓解且无病生存很长一段时间。但是,缓解率皆不高,而且相当一部分病人仍会复发(甚至短期内复发)并最终成为难治性白血病。由此可知,当前的治疗方法仍然存在不尽人意之处,急需新的治疗手段,而通过生物学手段筛选药物靶向作用的基因或通路,再进行针对性治疗就是这样一种方法。我们首先利用TBrowser软件挖掘与白血病可能相关的通路。然后结合基因芯片技术和生物信息学分析手段的优势,比较AML初诊及复发、难治时基因表达谱的差异,筛选出差异表达基因和这些基因富集的通路。最后运用实时荧光定量PCR初步验证目的基因的表达情况,以期发现难治性AML所具有的基因表达变化和相关的特异调控通路,为今后的治疗提供切实有效的药物靶点。方法：研究内容主要分为三个部分：第一部分：TBrowser软件挖掘来自KEGG、Biocarta、Reactome、CancerGenes的通路与白血病的关系。下载TBrowser软件,将各通路中的基因分别粘贴到查询面板中,自行调节选项,即可进行查询。在结果面板里,按下"Show"键,可看到一个新的面板,显示相应转录标签的ID号、平台和实验。查看各芯片实验的研究内容、分析方法以及实验结果,可得到相关信息。我们将通路与白血病的关联系数记录下来,并从文献中继续挖掘有效信息。第二部分：难治性急性髓系白血病基因表达谱的生物信息学分析。该组寡核苷酸基因芯片数据来自6位接受常规方案标准剂量化疗后首次持续完全缓解(CCR1)时间12个月以上和CCR16个月内复发的核型正常的AML-M2a患者。我们下载开源软件R,先用limma包预处理芯片数据(包括背景校正、片内处理及片间处理),再用RankProd包、samr包寻找差异表达基因,分析了初发非难治性AML(EAS)、初发难治性AML(DIF)及复发难治性AML (REL)三组的基因表达谱及其相互间的差异。另外,还对差异表达基因进行了功能富集分析,初步筛选导致AML难治的特异调控通路,为难治性AML的早期诊断和基因靶向治疗相关研究提供了一定的依据。综合生物信息学分析结果,提出15个目的基因进行下一步验证。第三部分：实时荧光定量PCR初步验证生物信息学分析结果。采用SYBR Green I法,将获赠的6例AML-M2a临床血液样本(其中初发2例,复发2例,难治2例)经分离骨髓单个核细胞、提取总RNA、反转录和实时荧光定量PCR,电脑自动给出内参基因和各个目的基因的Ct值,然后计算目的基因的2-△ΔCT值,从而分辨15个目的基因在三组比较之间的表达差异程度,并与芯片分析结果相比对。结果：经过TBrowser的寻找,在KEGG Pathways、Biocarta Pathways、Reactome Pathways和CancerGenes的所有通路中,与白血病关联度较大的共有88条。其中某些通路与白血病的关系已被证实,如MAPK pathway。经R分析,EAS、DIF、REL两两比较后得到三组差异表达基因(包括上调与下调)。功能富集分析结果表明,多个通路可能参与了AML最终演变为难治的过程,如干细胞与难治性AML的发生发展可能具有较为密切的关系。实时荧光定量PCR的结果与芯片数据分析结果对比,发现：(1)在难治-初发组中,FGF10、NCF2、PAX4的上下调趋势是相反的。(2)在复发-难治组中,RAC1、SMAD5和TGFBR1的上下调趋势是相反的。(3)在复发-初发组中,GATA1、GLI2、NCF2的上下调趋势是相反的。即芯片差异表达结果与实时荧光定量PCR所验证表达趋势的结果符合率在三个组别中皆为80%。基于各项分析与初步验证结果,提出难治性白血病特异调控通路关系的预测图,其中囊括了多条信号通路,它们共同影响基因转录、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡等等。结论：TBrowser挖掘发现了与白血病关联度较高的通路,为后续的研究奠定了理论基础。生物信息学分析及实时荧光定量PCR验证所得结果中,有部分基因的上下调规律是一致的,可初步认为它们在白血病演变为难治的过程中发挥了作用。这些基因参与的通路可能是难治性白血病特异的调控通路,这些通路的变化最终导致了癌症的发生。选择靶向这些基因或通路的药物,有可能是治疗难治性白血病的有效途径之一。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-11
目录  11-12
前言  12-24
第一章应用TBrowser软件寻找通路与白血病之间的关系  24-34
  1.1 材料与方法  25-27
  1.2 结果  27-31
  1.3 讨论  31-34
第二章难治性急性髓系白血病基因表达谱的生物信息学分析  34-48
  2.1 材料与方法  34-40
  2.2 结果  40-46
  2.3 讨论  46-48
第三章实时荧光定量PCR检测难治性急性髓系白血病相关基因的表达情况  48-66
  3.1 材料与方法  48-56
  3.2 主要仪器  56
  3.3 结果  56-62
  3.4 讨论  62-66
全文小结  66-67
参考文献  67-74
附录  74-77
攻读学位期间发表文章  77-78
致谢  78-81
统计学证明  81

难治性急性髓系白血病特异调控通路的初步研究

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