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核因子C（Nfic）调节磨牙牙根和切牙发育的初步研究

作　者: 张瑞
导　师: 黄晓峰
学　校: 首都医科大学
专　业: 口腔正畸学
关键词: 核因子C（Nfic）牙根发育 Shh β-catenin 牙本质涎磷蛋白（DSPP）骨钙素(OCN)
分类号: R783.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：本研究是为了探讨存在于牙齿间充质细胞内的核因子C（Nfic）在牙根发育中的作用，进一步从分子水平探讨影响牙根发育的机制，为牙根再生提供发育阶段的研究基础。并在降低口腔治疗风险的同时为正畸治疗提供更为广泛的适应症。方法：分别取野生型和Nfic基因敲除(Nfic^-/-)小鼠出生后第7.5、21.5（PN7.5、21.5）日龄磨牙和出生后第0.5、1.5、3.5、5.5、7.5、10.5、21.5（PN0.5、3.5、5.5、7.5、10.5、15.5、21.5）日龄下颌切牙作为实验对象，4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙，参照常规步骤进行石蜡切片和苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin,H.E.）染色。再选取PN3.5和PN5.5野生型和Nfic^-/-小鼠下颌切牙石蜡切片按标准方法用Shh和β-catenin的抗体进行免疫组织化学染色，观察以上两个基因的表达情况。并且取PN1.5的野生型和Nfic^-/-小鼠下颌切牙做体外培养实验，在培养液中加入不同蛋白（LiCl、Shh、Dkk1、BSA），培养7天后观察下切牙上皮结构、成釉母细胞、釉质、成牙本质细胞和牙本质的变化情况。另取PN7.5野生型和Nfic^-/-小鼠下颌切牙石蜡切片，使用包含牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙素（OCN）的cDNA片段的质粒载体制作RNA探针，地高辛标记,采用原位杂交技术来观察DSPP和OCN在出生后第7.5天时野生型和Nfic^-/-小鼠磨牙的表达情况。结果：1.磨牙（1）在PN7.5时，野生型和Nfic^-/-小鼠下颌第一磨牙牙冠和上皮根鞘结构正常，并且野生型能形成良好的根部牙本质，而Nfic^-/-小鼠磨牙在相当于牙根形成部位釉牙骨质界稍下方仅可以观察到一些类似于牙本质的钙化组织，其髓腔侧覆盖着少量的排列不整齐、极性紊乱、形态异常的成牙本质细胞。原位杂交结果显示，DSPP和OCN在野生型小鼠下颌第一磨牙的牙冠和新形成的牙根部的成牙本质细胞都有表达，而在Nfic^-/-小鼠仅表达在牙冠部，在牙根部没有表达，在冠根的分界点釉牙骨质界处形成明显的分界。（2）在PN21.5时，野生型小鼠的磨牙牙根发育基本完成，成牙本质细胞及牙本质发育良好，而Nfic^-/-小鼠磨牙不能形成牙根，成牙本质细胞形态异常，形成杂乱的细胞性牙本质。2.切牙H.E染色显示：（1）与野生型小鼠下切牙相比，从PN3.5至PN15.5，Nfic^-/-小鼠下切牙的长度明显较短小且釉质分化较差。伴随着切牙长度的增加，野生型小鼠下切牙的弯曲度亦相应增加，但在Nfic^-/-小鼠下切牙这一改变并不明显。（2）从PN0.5至PN15.5，野生型小鼠下切牙颊侧颈环缓慢增大并向舌侧弯曲，但在Nfic^-/-小鼠下切牙颈环仅能观察到体积的轻微增大，并且也没有弯曲现象发生。（3）在PN5.5、7.5、10.5和15.5Nfic^-/-小鼠下切牙颊侧均能发现没有牙本质及牙釉质的区域，而该区域在野生型小鼠是不存在的。（4）在PN0.5天时，Nfic^-/-小鼠下切牙的成牙本质细胞及牙本质形态还基本正常，但从PN3.5开始，成牙本质细胞的形态发生变异，排列不整齐且极性紊乱。同时新形成的钙化组织（类牙本质）形态也明显异常。从PN15.5Nfic^-/-小鼠下切牙冠状切片可以观察到，由于舌侧牙本质的缺失而形成了开口状态，并且在颊侧存在上皮断裂现象。免疫组化染色显示：在PN5.5天时，Shh在Nfic^-/-小鼠下切牙颈环及颈1/3处上皮内是没有表达的，而在野生型小鼠下切牙的颈1/3上皮内有表达；β-catenin的表达则刚好相反，在Nfic^-/-小鼠下切牙近颈环部位的颊侧上皮内有表达，而野生型小鼠下切牙相应部位没有表达。体外培养实验显示：PN1.5Nfic^-/-小鼠下颌切牙放在添加了Shh蛋白的培养液内培养7天后发现，切牙颈环上皮发生生长且呈分化趋势，同时连续性并未发生中断。在PN1.5野生型小鼠下切牙培养液中加入Wnt信号的激动剂LiCl后，发现下切牙颈环部有异常的成牙本质细胞和牙本质形成，且成牙本质细胞包埋在新形成的牙本质内，这与Nfic^-/-小鼠下颌切牙的表现型类似；但在Nfic^-/-小鼠下颌切牙培养液中加入Wnt信号的抑制蛋白Dkk1后，颈环部位新形成的成牙本质细胞分化和牙本质形成并未见明显改善。结论：（1）通过对小鼠磨牙的研究发现，Nfic^-/-小鼠磨牙牙冠及上皮根鞘形态正常，但是基本没有牙根形成。并且观察到OCN和DSPP在Nfic^-/-小鼠磨牙牙根部异常的成牙本质细胞内没有表达。这就说明了Nfic缺失后会导致牙乳头细胞不能向正常的成牙本质细胞分化，但是也不支持以往文献中所报道的牙乳头细胞向成骨细胞分化的趋势。（2）本实验纵向观察了小鼠下切牙的发育过程，结果发现在PN0.5时，Nfic^-/-小鼠下切牙形态及成牙本质细胞均未见明显异常。从PN3.5开始，异常趋势开始体现。间充质内的Nfic的缺失，可以使得小鼠下切牙长度变短、弯曲度减小、颊侧成牙本质细胞、牙本质、牙釉质形成异常以及舌侧牙本质缺如。并且，颊侧上皮内Shh的表达降低同时β-catenin的表达升高，这就提示在分子水平上Nfic与Shh和β-catenin有一定的关联。体外培养实验进一步证实了Nfic与Shh和β-catenin之间的关系。因此，本研究通过Nfic^-/-小鼠的下切牙模型，发现间充质内的Nfic可以抑制Wnt/β-catenin信号通路来调控成牙本质细胞的分化；并且还可以调节牙上皮细胞内Shh的表达来诱导成釉细胞的分化。

全文目录

缩略语表  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-12
研究一、Nfic 调节磨牙牙根发育的初步研究  12-21
  实验材料  12
  实验对象  12
  实验方法  12-16
  结果  16-19
  讨论  19-20
  结论  20-21
研究二、 Nfic 调节下切牙发育的初步研究  21-38
  实验材料  21
  实验对象  21
  实验方法  21-26
  结果  26-34
  讨论  34-37
  结论  37-38
全文总结  38-40
文献综述  40-46
参考文献  46-51
附录  51-52
病例报告  52-62
攻读学位期间发表论文情况  62-63
致谢  63-64
个人简历  64

核因子C（Nfic）调节磨牙牙根和切牙发育的初步研究

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