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MicroRNA-21在喉癌中的表达及其对喉癌侵袭与凋亡的调节

作　者: 任敬远
导　师: 孙亚男
学　校: 哈尔滨医科大学
专　业: 耳鼻咽喉头颈外科
关键词: miR-21 慢病毒喉鳞癌反义寡核苷酸增殖凋亡侵袭
分类号: R739.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的:检测喉癌组织及细胞中miRNA-21的表达。构建反义微小RNAhsa-miR-21 慢病毒表达载体,观察反义寡核苷酸重组慢病毒（ASO-miR-21）靶向调节Ras基因对喉癌细胞增殖、细胞周期、凋亡和抑制其侵袭的影响。方法:应用实时荧光定量PCR检测喉癌组织及细胞中miRNA-21的表达。构建反义hsa-miR-21慢病毒表达载体，体外转染喉鳞癌Hep-2细胞，采用MTT法及克隆形成实验检测反义miR-21（ASO-miR-21）重组慢病毒对喉癌细胞的增殖能力；应用流式细胞仪检测喉鳞癌细胞细胞周期及凋亡情况。采用Boydenchambers法检测喉鳞癌细胞的侵袭能力。采用免疫印迹法检测RAS蛋白在喉鳞癌细胞中的表达。结果:PCR检测在喉癌组织与细胞中，miRNA-21表达显著增高，并与临床病理分期及分级相关。成功构建反义hsa-miR-21的慢病毒表达载体，采用ASO-miR-21慢病毒抑制喉癌细胞内高水平表达miR-21的活性后,可显著抑制喉癌细胞增殖、诱导凋亡，及阻滞Hep-2细胞周期在G1期，并抑制其侵袭。Westernblot检测转染ASO-miR-21后的喉鳞癌细胞发现，Ras蛋白表达较对照组明显减少。结论:本研究发现喉癌组织与细胞中miRNA-21表达显著增高，转染miR-21ASO可以明显抑制喉癌细胞增殖、诱导凋亡，及阻滞Hep-2细胞周期在G1期，并抑制其侵袭。同时发现，miRNA-21能调节的Ras基因表达，参与其调控网络。从而说明miR-21的发挥致癌作用，为喉癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供的一个有效的靶标和理论依据。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-9
1、文献综述  9-18
  1.1 miRNA 编码基因结构  9-11
  1.2 miRNA 的生成及作用其机制  11-12
  1.3 miRNA-21 的表达及其对靶基因的调  12-15
    1.3.1 miRNA-21 在肿瘤中的表达  12-13
    1.3.2 miRNA-21 的靶基因及其调控  13-15
  1.4 miRNA-21 与肿瘤相关的信号转导通路  15-16
  1.5 miRNA-21 与肿瘤的诊断、治疗与预后  16-17
    1.5.1 miRNA-21 与肿瘤的诊断  16
    1.5.2 miRNA-21 与肿瘤的治疗  16
    1.5.3 miRNA-21 与肿瘤的预后  16-17
  1.6 展望  17-18
2、前言  18-19
3、材料与方法  19-34
  3.1 主要试剂和实验仪器  19-21
    3.1.1 实验试剂  19-20
    3.1.2 实验材料  20
    3.1.3 实验仪器  20-21
  3.2 实验方法  21-34
    3.2.1 组织标本收集  21
    3.2.2 实时荧光定量 PCR 检测 miRNA-21 在喉癌组织中的表达  21-24
    3.2.3 细胞培养  24-25
    3.2.4 慢病毒载体的构建与鉴定  25-28
    3.2.5 反义 miR-21 重组慢病毒转染喉鳞癌 Hep-2 细胞  28-29
    3.2.6 MTT 法检测细胞增殖率  29
    3.2.7 克隆形成实验检测喉鳞癌 Hep- 2 细胞的增殖  29
    3.2.8 细胞周期分析  29-30
    3.2.9 细胞凋亡分析  30
    3.2.10 细胞侵袭实验  30-31
    3.2.11 免疫印迹分析  31-33
    3.2.12 统计学处理  33-34
4、结果  34-49
5、讨论  49-53
6、结论  53-54
8、参考文献  54-63
9、个人简历  63

MicroRNA-21在喉癌中的表达及其对喉癌侵袭与凋亡的调节

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