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维素E琥珀酸酯诱导胃癌细胞凋过程中内质网应激与氧化应激的互作用

作　者: 黄晓莉
导　师: 吴坤
学　校: 哈尔滨医科大学
专　业:
关键词: 内质网应激维生素E琥珀酸酯细胞凋亡氧化应激胃癌
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

维生素E琥珀酸酯(RRR-α-tocopheryl succinate, VES)是维生素E的衍生物，能够抑制不同种系和不同组织来源的肿瘤细胞生长及诱导细胞凋亡。本研究以SGC-7901细胞为研究模型，探讨VES是否引起胃癌细胞发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）及其对细胞凋亡的影响，并阐明在VES诱导胃癌细胞凋亡过程中内质网应激与氧化应激的交互作用及其机制。本研究结果发现，VES能够诱导胃癌SGC-7901细胞发生凋亡，DAPI荧光染色可见典型的形态学改变。电子透射显微镜观察的结果显示，5μg/mLVES处理组内质网明显扩张、肿胀。Western blotting和RT-PCR的结果发现，20μg/mLVES作用人胃癌SGC-7901细胞后，葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)和葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein94, GRP94) mRNA表达增高，在翻译水平上GRP78的改变与转录水平基本一致，而5、10μg/mL VES处理SGC-7901细胞24h及20μg/mL VES处理6、12、18h后， GRP94蛋白表达显著降低。随着作用剂量和作用时间的延长，在翻译水平上VES对内质网膜上的跨膜蛋白PKR样的内质网蛋白激酶(PKR-like ER protein kinase,PERK)磷酸化及活化转录因子6(activating transcription factor6, ATF6)活化片段的诱导作用不断增强；在转录水平上，VES对活化转录因子4(activating transcription factor4, ATF4) mRNA的诱导作用也具有剂量依赖关系，而且X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein1, XBP1) mRNA从VES作用6h即开始出现剪切。VES明显促进caspase-4的裂解和c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）的磷酸化，具有剂量依赖关系和时间依赖关系，并在转录和翻译水平上显著诱导生长停滞及DNA损伤基因153（growth arrest and DNA damage-inducible gene153，CHOP/GADD153）的表达。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）淬灭SGC-7901细胞内活性氧后，20μg/mLVES对GRP78和CHOP mRNA及蛋白表达的促进作用均被显著抑制。siCHOP干扰阻断CHOP表达后，与单纯VES处理组相比，细胞内活性氧含量显著降低、谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化酶（glutathioneperoxidase, GPX）mRNA表达水平明显提高，而过氧化氢酶（catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutases, SOD）mRNA水平无明显变化。本研究结果表明，VES能够诱导SGC-7901细胞发生内质网应激，通过活化未折叠蛋白反应的信号转导通路激活ERS相应的凋亡分子，进而诱导细胞凋亡，在此过程中内质网应激和氧化应激具有交互作用，即VES诱导的内质网应激依赖于活性氧的生成，而CHOP通过调节活性氧产生、谷胱甘肽水平和谷胱甘肽过氧化酶表达以干扰细胞的氧化还原状态。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1、文献综述  11-21
  1.1 内质网的结构和生理功能  11-12
    1.1.1 内质网的结构  11
    1.1.2 内质网的生理功能  11-12
  1.2 内质网应激与未折叠蛋白反应  12-14
    1.2.1 PERK/elF2α信号转导途径  12-13
    1.2.2 ATF6 信号转导途径  13
    1.2.3 IRE1/XBP1 信号转导途径  13-14
  1.3 内质网应激介导细胞凋亡的机制  14-16
    1.3.1 CHOP 通路  14-15
    1.3.2 Caspase-12 通路  15
    1.3.3 JNK 通路  15
    1.3.4 Bcl-2 家族成员和钙离子信号  15-16
  1.4 内质网应激与疾病的关系  16-20
    1.4.1 内质网应激与肿瘤  16-18
    1.4.2 内质网应激与其它疾病  18-20
  1.5 展望  20-21
2、前言  21-22
3、材料与方法  22-36
  3.1 材料  22-25
    3.1.1 受试物  22
    3.1.2 细胞系  22
    3.1.3 试剂  22-24
    3.1.4 仪器  24-25
  3.2 实验方法  25-35
    3.2.1 细胞培养  25
    3.2.2 电镜观察内质网的形态  25
    3.2.3 RNA 瞬时干扰阻断 CHOP 表达  25-26
    3.2.4 Western blotting 法检测蛋白表达  26-30
    3.2.5 RT-PCR 法检测 mRNA 表达  30-33
    3.2.6 DAPI 染色检测细胞凋亡  33
    3.2.7 激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧水平  33
    3.2.8 流式细胞技术检测细胞内活性氧含量  33-34
    3.2.9 检测细胞内谷胱甘肽含量  34-35
  3.3 数据处理  35-36
4、结果  36-56
  4.1 VES 对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的影响  36-37
  4.2 VES对SGC-7901细胞内质网形态的影响  37
  4.3 VES对SGC-7901细胞内质网分子伴侣的影响  37-40
    4.3.1 VES 对 SGC-7901 细胞内质网分子伴侣蛋白表达的影响  37-39
    4.3.2 VES 对 SGC-7901 细胞内质网分子伴侣 mRNA 表达的影响  39-40
  4.4 VES对SGC-7901细胞内质网应激诱导凋亡关键分子的影响  40-43
    4.4.1 不同剂量 VES 对胃癌细胞内质网应激诱导凋亡关键分子的影响  40-41
    4.4.2 VES 作用胃癌细胞不同时间对内质网应激诱导凋亡关键分子的影响  41-43
  4.5 VES 对 SGC-7901 细胞未折叠蛋白反应转导通路信号分子的影响  43-47
    4.5.1 不同剂量 VES 对 SGC-7901 细胞未折叠蛋白反应转导通路信号分子的影响  43-45
    4.5.2 VES 作用 SGC-7901 细胞不同时间对未折叠蛋白反应转导通路信号分子的影响  45-47
  4.6 VES 诱导人胃癌细胞凋亡过程中内质网应激与氧化应激的交互作用  47-56
    4.6.1 淬灭 SGC-7901 细胞内活性氧对 VES 诱导内质网应激的影响  47-50
    4.6.2 阻断 CHOP 对细胞凋亡和氧化应激相关指标的影响  50-56
5、讨论  56-64
  5.1 VES 对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的影响  56-57
  5.2 VES 对人胃癌 SGC-7901 细胞内质网应激的影响  57-58
  5.3 VES 诱导人胃癌细胞内质网应激过程中未折叠蛋白反应的作用  58-59
  5.4 内质网应激在VES诱导人胃癌细胞凋亡过程中的作用及其机制  59-60
  5.5 VES 诱导人胃癌细胞凋亡过程中内质网应激与氧化应激的交互作用  60-62
    5.5.1 VES 处理人胃癌细胞后淬灭活性氧对内质网应激的影响  61-62
    5.5.2 VES 处理人胃癌细胞后阻断 CHOP 表达对氧化应激的影响  62
  5.6 小结  62-64
6、结论  64-66
7、参考文献  66-85
8、个人简历  85-86

维素E琥珀酸酯诱导胃癌细胞凋过程中内质网应激与氧化应激的互作用

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