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ROS/AMPK介导的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌作用中的机制研究

作　者: 易波
导　师: 邵江华
学　校:
专　业: 普通外科学
关键词: 胃癌 SGC7901细胞 川芎嗪 AMPK 氧化应激 凋亡 线粒体 Bax 细胞色素C
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


胃癌是消化系统最为常见的恶性肿瘤,整体预后不佳,化疗是其主要治疗手段之一。但是,现有的化疗药物存在着副作用大、化疗耐药等诸多问题,因此,从天然药物中寻找有效的胃癌辅助治疗药物,可为胃癌治疗提供新的途径。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMPZ)是从川芎中提取的一种生物碱单体,其传统治疗作用主要表现为改善微循环、抗氧化应激方面。近些年来,川芎嗪在抗肿瘤治疗方面逐渐成为国内学者研究的热点,并有研究指出川芎嗪能逆转胃癌细胞多药耐药,但是,川芎嗪是否本身有抗胃癌作用,其机制又是什么,迄今为止,并无研究报道。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是细胞内的“能量调节器”,AMPK在能量缺乏时被激活,能量过量时抑制,其激活后能抑制细胞内蛋白质、脂肪酸、多糖的合成,这些过程为肿瘤细胞增殖、发展所必须。并且我们在对临床标本的检测中发现,AMPK的活性状态磷酸化AMPK (phosph-AMPK)的表达在胃癌组织中几乎检测不到或仅微弱表达。那么,川芎嗪是否可以通过激活AMPK来达到抑制胃癌生长的目的呢?目前为止,尚无任何文献报道。本课题以SGC7901胃癌细胞为研究对象,研究TMPZ在不同药物浓度、不同时间点对SGC7901胃癌细胞生长情况、凋亡的影响。在明确TMPZ可抑制胃癌细胞生长、促进细胞凋亡的基础上,从ROS/AMPK信号通路途径对TMPZ抗胃癌作用机制进行探讨,现将本论文主要研究结果归纳如下：1,收集病理确认的胃癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织,免疫组化检测磷酸化AMPK (p-AMPK)的表达情况。结果显示,p-AMPK在正常组织中94%阳性表达,其阳性表达率高于癌旁组织72%(36/50)及胃癌组织4%(2/50),而癌旁组织中p-AMPK蛋白表达显著高于胃癌组织。进一步的Western blot结果显示p-AMPK蛋白表达量在正常组织为0.93±0.14、癌旁组织为0.43±0.08,胃癌组织为0.07±0.01,差异有显著性(P<0.05)2.探讨了TMPZ对SGC7901胃癌细胞的量效、时效关系。以不同浓度梯度的TMPZ (0,0.5,1,2,4,6,8mM)处理6,12,24,48h以后,噻唑蓝(MTT)比色法观察SGC7901细胞的生长情况。不同浓度梯度的TMPZ作用于SGC7901胃癌细胞24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果发现,低浓度的TMPZ对胃癌细胞生长无明显影响,较高浓度的TMPZ(4,6,8mM)在24h开始明显抑制胃癌细胞生长；并且,在TMPZ处理24h后明显诱导肿瘤细胞的凋亡,其作用呈一定的浓度依赖性；同时我们进一步证实,较高浓度的TMPZ对人胃黏膜上皮细胞GES-1、人脐静脉内皮细胞HUVECs、心肌样细胞H9c2的细胞凋亡并不产生明显影响；3.针对高浓度的TMPZ呈剂量依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡,流式细胞仪检测高浓度TMPZ对ROS生成的影响,结果发现,高浓度的TMPZ呈浓度依赖性地升高肿瘤细胞ROS的含量,并且抑制细胞生长；给予ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)之后,ROS含量明显下降,并且高浓度的TMPZ不再能抑制肿瘤细胞的生长；4. Western blot法检测高浓度的TMPZ对胃癌SGC7901细胞AMPK磷酸化激活的影响。结果发现高浓度的TMPZ呈剂量依赖性地激活AMPK,使AMPK磷酸化水平增多,但是给予NAC之后,高浓度TMPZ所诱导的AMPK的磷酸化激活被取消；5.使用AMPK特异性的阻断剂Compound C,深入探讨高浓度TMPZ通过ROS/AMPK信号通路介导通过线粒体凋亡途径。结果表明,TMPZ通过激活AMPK,促使Bax从胞浆向线粒体迁移,使线粒体膜电位崩解,细胞色素C (cytochromec,Cyt c)从线粒体释放至胞浆中,然后激活caspase-9、caspase-3,从而导致胃癌SGC7901细胞凋亡。综上所述,从临床胃癌组织标本中AMPK活性被显著抑制这一现象得到启发,对TMPZ抗胃癌细胞SGC7901作用及机制进行研究发现：TMPZ高浓度抑制胃癌细胞生长,促进胃癌细胞凋亡,但并不会对其它细胞产生明显的影响。其机制可能是高浓度TMPZ诱导产生大量ROS,从而激活AMPK,促使Bax从胞浆迁移至线粒体,导致线粒体膜电位崩解,Cyt c释放至胞浆,激活caspase-9、caspase-3,最终导致肿瘤细胞凋亡。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
縮略词表  13-15
第1章 引言  15-19
第2章 AMPK磷酸化激活状态在胃癌组织中的表达  19-35
  1. 材料与方法  20-28
    1.1 研究对象  20
    1.2 标本收集  20
    1.3 主要试剂  20-21
    1.4 实验主要仪器和设备  21-23
    1.5 实验方法  23-27
    1.6 统计学处理  27-28
  2. 实验结果  28-31
    2.1 免疫组化检测p-AMPK的表达  28-30
    2.2 Western blot检测p-AMPK的表达  30-31
  3. 讨论  31-34
    3.1 AMPK的结构和分布  31-32
    3.2 AMPK的生物学活性  32-33
    3.3 AMPK在胃癌中的表达及意义  33-34
  4. 本章小结  34-35
第3章 ROS/AMPK介导的川芎嗪抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡的机制研究  35-62
  第1节 川芎嗪对胃癌细胞SGC7901增殖及凋亡的影响  35-49
    1. 材料与方法  35-42
      1.1 实验细胞  35-36
      1.2 主要试剂  36
      1.3 实验主要仪器和设备  36-37
      1.4 实验方法  37-41
      1.5 统计学分析  41-42
    2. 实验结果  42-46
      2.1 TMPZ对胃癌细胞SGC7901增殖的影响  42-43
      2.2 TMPZ对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响  43-45
      2.3 TMPZ对人胃黏膜上皮细胞GES-1、人脐静脉内皮细胞HUVECs、心肌样细胞H9c2凋亡的影响  45-46
    3. 讨论  46-48
      3.1 TMPZ的一般药理作用  46
      3.2 TMPZ的抗肿瘤作用  46-48
    4. 小结  48-49
  第2节 ROS/AMPK信号通路介导川芎嗪抗癌作用机制研究  49-62
    1. 材料与方法  50-54
      1.1 实验细胞  50
      1.2 主要试剂  50
      1.3 实验主要仪器和设备  50
      1.4 实验方法  50-53
      1.5 统计学分析  53-54
    2. 实验结果  54-59
      2.1 高浓度TMPZ对胃癌细胞SGC7901ROS生成的影响  54-55
      2.2 高浓度TMPZ对胃癌细胞SGC7901脂质过氧化和抗氧化酶系的影响  55
      2.3 ROS清除剂NAC对胃癌细胞SGC7901 ROS生成的影响  55-57
      2.4 ROS清除剂NAC逆转TMPZ所致胃癌细胞SGC7901生存率降低  57
      2.5 ROS介导TMPZ所致的AMPK磷酸化激活  57-59
    3. 讨论  59-61
      3.1 ROS的产生与消除  59-60
      3.2 ROS与肿瘤的关系  60-61
    4. 小结  61-62
第4章 AMPK介导的线粒体凋亡途径在川芎嗪抗胃癌作用中的研究  62-76
  1. 材料与方法  63-66
    1.1 主要试剂  63
    1.2 实验主要仪器和设备  63
    1.3 实验方法  63-65
    1.4 统计学分析  65-66
  2. 实验结果  66-73
    2.1 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞AMPK磷酸化激活的阻断作用  66-67
    2.2 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响  67-68
    2.3 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901 ROS生成的影响  68
    2.4 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901线粒体膜电位的影响  68-70
    2.5 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901 Bax线粒体、胞浆分布的影响  70-71
    2.6 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901细胞色素C从线粒体释放的影响  71-72
    2.7 AMPK阻断剂Compound C对胃癌细胞SGC7901 Caspase-9,Caspase-3表达的影响  72-73
  3. 讨论  73-74
    3.1 线粒体依赖途径在细胞凋亡中的作用  73-74
    3.2 Bax调控线粒体凋亡途径的机制  74
  4. 本章小结  74-76
第5章 结论  76-77
致谢  77-78
参考文献  78-93
攻读博士学位期间的研究成果  93-94
综述  94-103
  参考文献  99-103

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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