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Bufalin通过抑制mTOR/P70S6K通路的活化诱导ECA109细胞凋亡

作　者: 吕文侠
导　师: 王小玲；刘月平
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 食管癌 ECA109细胞株 Bufalin mTOR/P70S6K通路转染 Western Blot 凋亡
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

食管癌是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶性病变。我国是食管癌的高发国家，其最常见的组织学类型是鳞状细胞癌。目前对食管癌采取多种治疗方法，主要是手术辅助放化疗，但由于其早期症状不明显，不易察觉，病人就诊时部分已是中晚期，故预后不佳。大量分子生物学研究资料表明，食管癌的发生发展是多阶段、多基因参与的过程，并且存在信号通路异常活化及相关蛋白的表达增强。因此，进一步研究抗肿瘤药物对食管癌的影响及有关信号转导途径的活化，依然是食管癌治疗研究的目标。多个研究报道证明，Akt/mTOR/P70S6K (70kDa ribosomal protein S6kinase)信号传导通路在肿瘤发生发展中存在异常的激活。Akt/mTOR被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化、迁移等调节。mTOR是一种多功能激酶，参与许多重要细胞功能的调节，其活化磷酸化P70S6K可促进mRNA翻译，生成细胞周期跨越G1期所必需的各种蛋白，抑制mTOR可致P70S6K磷酸化受阻，进而抑制翻译进程，使细胞周期停滞并诱导凋亡。Bufalin是一种毒性配基，提取于中药蟾酥，来源于黑眶蟾蜍和中华大蟾蜍耳后、皮肤腺分泌之浆液，属蟾毒甾烯类化合物。国内外研究显示，它可以诱导多种白血病细胞和一些实体瘤细胞凋亡，并下调Bcl-2、c-myc、WT-1等肿瘤相关基因的表达。但其诱导凋亡的确切机制仍不清楚。目前关于蟾蜍灵诱导食管癌细胞凋亡机制的研究很少，本实验以食管癌ECA109细胞为模型，观察Bufalin抑制mTOR/P70S6K通路的活化，从而诱导ECA109细胞凋亡，以探讨其可能的机制。目的：探讨Bufalin通过抑制mTOR/P70S6K通路的活化诱导ECA109细胞凋亡过程中的作用。方法：1将携带高活性mTOR基因质粒wtmTOR转化至DH5α大肠杆菌中进行扩增，并使用脂质体法将wtmTOR成功转染到食管癌ECA109细胞中，Western Blot方法分别检测转染质粒0h、12h、24h、30h、36h、42h、48h后细胞内P70S6K的蛋白表达及其磷酸化水平（p-P70S6K）的变化，并得出转染的最佳时间。2用Western Blot方法分别检测60nmol/l Bufalin作用于ECA109细胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后细胞内cIAP-1、BAD的蛋白表达。3用Western Blot方法分别检测不同处理组（对照组、空载体转染组、wtmTOR转染组、转染后加Bufalin组）细胞内P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1及BAD的蛋白的变化，进而研究转染wtmTOR质粒及Bufalin对mTOR通路和细胞凋亡的影响。4采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。5用TUNEL标记法检测细胞的凋亡指数。6采用倒置显微镜及Gimsa染色观察细胞形态学变化。结果：1成功将wtmTOR质粒扩增并转染到食管癌细胞中，检测其下游基因的蛋白表达。（1）P70S6K在转染不同时间后蛋白水平无明显变化（0.599±0.011，0.594±0.013，0.606±0.012，0.608±0.010，0.592±0.017，0.599±0.021，0.600±0.036，P＞0.05），差异无统计学意义。（2）p-P70S6K随转染后时间的增加（0h、12h、24h）表达量逐渐升高，至24h达到最高值，此后（30h、36h、42h、48h）开始下降（0.389±0.013，0.411±0.019，0.609±0.016，0.573±0.015，0.394±0.013，0.383±0.006，0.262±0.018，P＜0.05），差异具有统计学意义。2Western Blot检测60nmol/l Bufalin作用于ECA109细胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后细胞内cIAP-1和BAD的蛋白表达变化。（1）cIAP-1的蛋白水平逐渐降低（0.542±0.003，0.517±0.007，0.455±0.002，0.414±0.004，0.369±0.026，0.218±0.015，P＜0.05），差异具有统计学意义。（2）BAD的蛋白水平逐渐升高（0.456±0.009，0.659±0.042，0.750±0.023，0.813±0.019，0.937±0.013，1.047±0.013，P＜0.05），差异具有统计学意义。3Western Blot结果显示不同处理组间细胞内P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1和BAD的蛋白表达变化。（1）P70S6K的蛋白水平在不同处理组间无明显差别（0.901±0.045，0.914±0.023，0.900±0.020，0.898±0.022，P＞0.05），差异无统计学意义。（2）p-P70S6K的蛋白水平在wtmTOR转染组的表达明显高于对照组和空载体转染组，当转染后加入Bufalin2h，p-P70S6K蛋白水平又受到抑制，明显下降(0.761±0.085，0.766±0.068，0.952±0.059，0.762±0.019，P＜0.05），差异具有统计学意义。（3）cIAP-1的蛋白水平在wtmTOR转染组的表达明显高于对照组和空载体转染组，转染后加入Bufalin24h，cIAP-1蛋白水平又受到抑制，明显下降(0.721±0.019，0.731±0.248，0.840±0.010，0.742±0.021，P＜0.05），差异具有统计学意义。（4）BAD的蛋白水平在wtmTOR转染组的表达低于对照组和空载体转染组，当转染后加入Bufalin24h，BAD蛋白水平又明显升高（0.929±0.046，0.944±0.060，0.779±0.182，1.029±0.049，P＜0.05），差异具有统计学意义。4流式细胞仪结果显示：（1）0、20、40、60、80、100nmol/l Bufalin处理ECA109细胞24h，细胞凋亡率逐渐升高(3.01±0.317%，3.67±0.306%，6.74±0.198%，7.59±0.340%，18.22±0.651%，28.60±1.737%，P＜0.05）；并出现明显的G2/M期阻滞，G2/M期细胞百分比由对照组的9.24±1.919%增加至70.5±2.934%，差异具有统计学意义。（2）流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡率，wtmTOR转染组的凋亡率明显低于对照组和空载体转染组，转染后加入Bufalin24h，细胞凋亡率又明显升高（5.60±0.411%，5.46±0.341%，4.19±0.210%，10.12±0.325%，P＜0.05），差异具有统计学意义。5TUNEL标记法显示：细胞核棕黄色着染者为凋亡细胞，而正常细胞的胞核不着染。0、20、40、60、80、100nmol/l Bufalin处理ECA109细胞24h，凋亡指数随用药浓度增加逐渐升高（2.13±0.431%，5.56±1.345%，7.87±1.443%，15.17±2.657%，36.69±2.986%，50.98±2.978%，P＜0.05），差异具有统计学意义。6Bufalin作用于ECA109细胞后细胞的形态学改变（1）倒置显微镜观察：随着药物作用时间的延长，可见细胞皱缩，由多角形变为圆形，细胞表面逐渐凸起小膜泡,细胞不断地脱落悬浮于培养液中。活细胞数量明显减少，死亡细胞增多。（2）Gimsa染色观察：Bufalin作用于ECA109细胞24h后，出现典型的凋亡改变，表现为细胞膜完整，胞浆中出现空泡、核染色质浓缩、碎裂成块弥散在细胞浆中，并可见膜结构包裹的凋亡小体。同时可见少量坏死细胞，细胞轮廓不清，细胞核溶解消失。结论：1Bufalin以时间依赖性方式促进BAD的表达，抑制cIAP-1蛋白表达，从而促进食管癌ECA109细胞凋亡。2Bufalin通过抑制mTOR/P70S6K通路的活化诱导ECA109细胞凋亡。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-14
材料与方法  14-25
结果  25-27
附图  27-36
附表  36-40
讨论  40-42
结论  42-43
参考文献  43-46
综述 IAPs蛋白在肿瘤发生、发展中的研究进展  46-58
  参考文献  54-58
致谢  58-59
个人简历  59

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