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促肾上腺皮质激素释放因子诱导U87细胞凋亡机制的初步研究

作　者: 武强
导　师: 王立群
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: CRF U87细胞荧光定量PCR CCK8 凋亡
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

背景：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的50%，其具有高发病率及致死率的特点。传统的治疗方法包括手术，放疗，化疗，但治疗效果仍较差，尤其是针对胶质母细胞瘤，即使应用上述综合治疗，其平均生存期尚不足14.6个月。随着人们对胶质瘤发病机制的进一步认识，神经肽类物质在胶质瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。促肾上腺激素释放因子（corticotropin-releasing factor CRF）是一类最早由vale从羊下丘脑中分离出的含有41个氨基酸的激素类神经肽。主要分布于人类中枢神经系统，以下丘脑为著，外周系统中分布广泛。CRF主要作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA），调节机体在应激状态下的内分泌，自主神经，免疫反应等方面的协调。近年来，CRF作为一类重要的神经内分泌肽，其在肿瘤方面的作用也逐渐被重视起来。CRF对其他系统肿瘤的作用表现在：CRF可以通过CRFR1的激活抑制乳腺癌细胞生长；CRF通过CRFR2的激活抑制人小细胞肺癌细胞的生长；尿皮素通过CRFR2抑制肝细胞癌的肿瘤生长和血管的生成。但是，CRF对脑胶质瘤的作用及机制国内外鲜有报道。目的：探索CRF对U87细胞凋亡的作用和在不同浓度的CRF作用下，对U87细胞中CRFR1，PCNA，caspase-3， cytC蛋白表达的影响及fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表达的影响。方法：1CCK8法检测U87细胞凋亡复苏U87细胞接种于96孔培养板中，每组置3个重复孔。37℃，5%CO2，湿化空气培养24h后，更换入含有CRF的DMEM培养基（浓度分别为0，10-7，10-8，10-9mol/L），设立空白对照组（不含CRF及细胞）,在24h时间点加入cck-8(10ul/孔)，培养箱中作用3h后检测细胞的OD值（450nm）。2Western-blot检测CRFR1，PCNA，caspase-3，，cytC蛋白表达提取24h组细胞总蛋白，匀浆器匀浆，BCA法蛋白浓度定量，加入上样缓冲液煮沸5min，总蛋白60μg上样到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质转印至PVDF膜，转膜条件为205mA，1.5h。5%脱脂奶粉室温封闭2h后，TBS漂洗3次，每次5分钟。CRFR1(1:500)，PCNA（1:800），caspase-3（1:800），cytC (1:800)，β-actin(1:500)在上述一抗溶液中4℃孵育过夜。TBS洗膜5min，羊抗兔二抗溶液中常温孵育60min。化学发光仪中发光成像，并经Image J对蛋白条带进行灰度分析，计算蛋白相对值=蛋白A值/β-actin值。3荧光定量PCR检测fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表达Trizol法提取细胞总RNA，1.2%凝胶电泳检测其完整性。按反转录试剂盒说明书合成cDNA,进行聚合酶链反应。应用DNAman软件设计fas/fasl，Bcl-2/Bax引物序列，由北京赛百盛公司合成。置于AB7300PCR仪，95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，40个循环；最后，产物在72℃延伸5min。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异，记录结果数据。结果：1CCK-8细胞凋亡检测：不同浓度CRF处理的U87细胞凋亡率存在差异，有统计学意义（F=35.79，P<0.05）。2Western-blot检测：CRFR1蛋白的实验组高于对照组,差异显著(F=83.32,P <0.05)。PCNA蛋白的实验组高于对照组,差异显著(F=36.19,P <0.05)。cytC蛋白的实验组高于对照组,差异显著(F=11.93,P <0.05)。caspase-3蛋白的实验组高于对照组,差异显著(F=44.82,P <0.05)。3荧光定量PCR检测： Bcl-2mRNA的实验组低于对照组,差异显著(F=138.82,P <0.05)。Bax mRNA的实验组高于对照组,差异显著(F=215.25,P <0.05)。不同浓度CRF干预的U87细胞Fas mRNA的表达不全相同，有统计学意义(F=14.5,P <0.05)。不同浓度CRF处理的U87细胞Fasl mRNA的表达不全相同，有统计学意义(F=54.14,P <0.05)。结论：1CCK8实验显示CRF对胶质瘤U87MG具有促进凋亡的作用。2Western-blot印迹结果显示CRF可以上调CRFR1的表达，凋亡相关蛋白capase-3，cytC的表达与细胞凋亡趋势一致，PCNA蛋白表达显示细胞周期阻滞在G2期之前。3荧光定量PCR结果显示Bcl-2/Bax，fas/fasl mRNA的表达与细胞凋亡趋势一致。综上所述，CRF在一定程度上促进了U87细胞的凋亡，且这有可能通过上述凋亡因子及凋亡途径对U87细胞发挥作用。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
英文缩写  11-12
前言  12-13
材料与方法  13-20
结果  20-22
附图  22-26
附表  26-27
讨论  27-29
结论  29
参考文献  29-32
综述 CRF 家族在细胞凋亡中的作用  32-43
  参考文献  38-43
致谢  43-44
个人简历  44

促肾上腺皮质激素释放因子诱导U87细胞凋亡机制的初步研究

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