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在hSOD1^G93A转基因小鼠中Nrf2对ATF4蛋白表达影响的研究

作　者: 王静静
导　师: 卜晖
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 肌萎缩侧索硬化腰髓 Nrf2 ATF4 SOD1 转基因小鼠
分类号: R746.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是运动神经元病中最常见的类型，该病的特点是上下运动神经元变性，上运动神经元受累表现为痉挛、构音障碍和吞咽困难等；下运动神经元受累表现为肌肉萎缩、肌束颤动等。大约90%的肌萎缩侧索硬化病例为散发性(sporadicALS,sALS),10%为家族性肌萎缩侧索硬化(familial ALS,fALS)。1/5的fALS病例与突变的铜锌超氧化物歧化酶Ⅰ型(Cu/Zn superoxide dismutase1,SOD1)有关。其中以突变的G93A位点最常见，即基因密码子第93位点上的丙氨酸被甘氨酸替代。SOD1G93A转基因小鼠表现为进行性加重的运动神经元变性，与人类运动神经元病相似，是国际上公认研究ALS的动物模型。用转染了人类突变的SOD1(human mutant SOD1,hmSOD1)的转基因小鼠进行实验研究，发现hmSOD1通过很多途径损害运动神经元，例如：氧化应激反应、错误折叠/未折叠蛋白聚集、线粒体功能受损、谷氨酸兴奋毒性等。近年来许多学者提出了内质网应激学说。内质网是一个多功能细胞器，它是蛋白质的合成、加工处理和折叠的场所，也是钙离子的储存库。当钙离子平衡紊乱或错误折叠/未折叠蛋白在内质网腔内积聚时就可以诱发内质网应激，紧接着触发未折叠蛋白反应来辅助蛋白质折叠以减轻内质网应激。适当的内质网应激可以起到细胞保护功能，但细胞中发生过度的内质网应激则可以引起细胞功能障碍，甚至细胞凋亡。内质网膜表面存在三种跨膜蛋白，分别为PERK（PKR-like ERkinase）、ATF6（activating transcription factor6）和IRE1（inositol-requiringenzyme1）。当发生ERS时，这几种蛋白分别与内质网上的分子伴侣GRP78分离而被激活，激活的蛋白分别介导三条通路。PERK通路是三条通路中最早被激活的，PERK与GRP78分离后通过自身的二聚化和磷酸化而被激活，磷酸化的PERK（pPERK）使eIF2α51位丝氨酸发生磷酸化，从而使蛋白质的合成减缓或者停止。磷酸化的eIF2α(peIF2α)激活ATF4，引起ERAD、GADD34、CHOP蛋白表达的增多，GADD34负反馈性的调节eIF2α的磷酸化。磷酸化的PERK在激活eIF2α的同时也使Nrf2（Nuclear Factor Erythroid2-Related Factor2）与Keap1分离并活化，活化的Nrf2由细胞浆转移到细胞核，并需要在ATF4的协同作用下上调二相解毒酶的表达，从而促进细胞存活。Taras Afonyushkin等人研究表明eIF2α上调ATF4的翻译，而Nrf2上调ATF4mRAN的转录。Nrf2和ATF4相互结合后与一些二相解毒酶基因上的ARE序列结合，上调二相解毒酶的表达，以此调节细胞的氧化还原平衡，维持细胞内环境稳态。本实验通过与Nrf2-/-小鼠杂交制备敲除Nrf2的hmSOD1G93A小鼠，并以此为研究对象，使用免疫组织化学及激光共聚焦方法研究不同时期运动神经元数目及ATF4表达部位变化情况，通过免疫印迹方法研究ATF4在不同时期小鼠的变化情况及Nrf2对其表达的影响情况。方法：1动物模型的饲养及鉴定所有小鼠均饲养在SPF（specific pathogen free）环境中，即恒湿、恒温（25-27℃）以及无特定病原菌的环境，以无菌水、及灭菌的SPF级颗粒鼠粮喂养。动物实验的过程遵守河北省实验室动物管理规定。实验所用小鼠均从美国Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)买进。将SOD1G93A转基因小鼠与Nrf2-/-小鼠杂交，制备Nrf2敲除的SOD1G93A转基因小鼠。采用剪取子代小鼠尾尖的方法获取子代小鼠的DNA，利用PCR扩增技术，鉴定是否带有Nrf2及SOD1G93A基因。2免疫印迹按照Snow RJ的评分标准将实验小鼠分为症状前期组（0分，约出生后60天）、症状早期组（2分，约出生后90天）和终末期组（5分，约出生后120天），每组均设立同窝同性别同年龄对照。新鲜获取小鼠腰髓，保存于-80℃冰箱备用。采用抽提裂解法提取蛋白，通过western bolt方法测定ATF4在Nrf2+/+G93A转基因小鼠不同时期的表达并在终末期小鼠中研究敲除Nrf2对ATF4表达的影响。3免疫组化将Nrf2+/+G93A转基因小鼠分为三组（症状前期、症状早期和终末期），每组均设立同窝同性别同年龄对照。用多聚甲醛固定小鼠的腰髓。振荡切片后，保存于4℃备用。将小鼠腰髓进行ATF4免疫组化染色。4激光共聚焦腰髓标本经4%多聚甲醛固定后，用振动切片机切成25um厚的薄片，与免疫组化步骤相似，一抗孵育后，FITC、Cy5分别标记羊抗兔、羊抗鼠二抗。并加Hochest核荧光染色剂孵育后，抗衰减荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察抗体分布位置，探讨Nrf2对ATF4表达部位的影响。结果：免疫印迹方法观察ATF4在转基因小鼠的表达量，发现对照组小鼠表达量较少，且在60-120天之间随年龄的增长无明显差异性。在Nrf2+/+G93A小鼠的腰髓中， ATF4的表达在症状前期就有所升高（P>0.05），在症状早期明显升高(P<0.05)，终末期有所下降（P<0.05）。ATF4在Nrf2+/+G93A终末期小鼠的表达比在Nrf2-/-G93A终末期小鼠显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示随着疾病的进展运动神经元细胞数逐渐减少，且组织出现空泡化，ATF4的表达在症状前期较对照组无明显差异，在症状早期组可见显著升高，终末期组可见表达减少。激光共聚焦显微镜结果显示随着内质网应激的发生ATF4由胞浆移位到胞核，并且ATF4的移位与Nrf2无关。结论：SOD1G93A转基因小鼠存在内质网应激，ATF4表达随病程进展进行性增多；敲除Nrf2可一定程度上抑制ATF4表达，加重病情进展。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11
材料与方法  11-19
结果  19-21
附图  21-29
附表  29-30
讨论  30-33
结论  33-34
参考文献  34-37
综述  37-48
  参考文献  42-48
致谢  48-49
个人简历  49

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