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嗅鞘细胞表型特性和对mSOD1~（G93A）ALS大鼠的治疗研究

作　者: 李莹
导　师: 黄红云；段耀奎
学　校: 泰山医学院
专　业: 神经生物学
关键词: 嗅鞘细胞嗅球免疫组织化学人胚胎中枢神经系统神经修复肌萎缩侧索硬化症 S0D1G93A转基因大鼠神经修复
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的大量的临床研究显示,嗅鞘细胞移植可治疗多种中枢神经系统疾病。然而目前临床所使用的嗅鞘细胞严格意义上说,是嗅球来源以嗅鞘细胞为主的混合细胞。本实验的目的旨在更深入的研究和讨论临床移植所用嗅鞘细胞各种成分的含量及其在嗅神经层和嗅球小球层的分布情况。方法1.嗅球免疫组织学研究：取孕20周胚胎嗅球标本,4%的多聚甲醛固定液固定2小时,随后置于蔗糖溶液中,待沉糖后做连续冰冻切片。分别做P75与S100β、Laminin、Nestin及GAFP染色,并以Hoechest做核染。2.嗅鞘细胞的培养：无菌条件下,用显微器械将胚胎的嗅球取出,在解剖显微镜下仔细剥离嗅球表面的软磨和血管,尽量保持嗅球的完整性,然后用眼科剪反复剪碎,剪成0.5-1.0mm3大小的组织块,将组织块移入离心管内,加入含有13%胎牛血清的D/F12培养液,用弯头吸管来回轻轻吹打组织块,制成细胞悬液,胰蛋白酶消化后收集细胞,以20%的血清培养基制成细胞悬液平均铺入细胞培养板中,在CO2培养箱中培养。3.嗅鞘细胞的鉴定：将培养好的细胞以105/ml的浓度接种于置放盖玻片的24孔培养板中。待完全贴壁后以4%的甲醛固定。PBS清洗后,以10%的山羊血清封闭1小时,滴加以封闭液配置的一抗孵育1小时。PBS清洗后滴加二抗,并以Hoechest做核染。4.激光共聚焦显微镜观察及细胞计数：染色后的冰冻切片及细胞培养片使用用蔡司LSM510共聚焦显微镜观察染色结果,并使用蔡司Axio视觉软件进行细胞计数。结果1.人胚胎嗅鞘细胞在嗅神经层的分布：嗅神经层的外层有强烈的P75NTR阳性细胞表达,且周围有大量的轴突束,而内层的表达较弱。同样的,在ONL的外层和内层均表达GFAP,但并不共染。2.人胚胎嗅鞘细胞在嗅球小球层的分布：嗅球的小球层位于ONL的深部,P75NTR阳性的嗅鞘细胞包绕于小球层外侧,GAP-43也可强烈表达,并包绕整个小球层。MAP-2可用来标记小球层中心的神经元树突,特别是早期发育的嗅球中间位置3.人胚胎嗅鞘细胞的免疫组织化学特征：人胚胎嗅鞘细胞的培养分为两组。一部分为嗅鞘细胞的小组织块培养,另一部分为嗅鞘细胞培养。大约有21.45%的P75NTR阳性细胞及32.51%的GFAP阳性细胞,但不共染；P75NTR阳性细胞与部分S100β共染。几乎所有的GFAP阳性的嗅球细胞与部分S100β完全共染；几乎全部的P75NTR阳性嗅球嗅鞘细胞与NCAMs共染,并分布于组织块的周围及内部；部分P75NTR阳性嗅鞘细胞与nestin共染；P75NTR阳性OB-OEC细胞完全不于FBN-1共染。结论在孕20周的胚胎嗅球中,P75NTR阳性的嗅鞘细胞分布于嗅球的嗅神经层外缘,并参与小球层的形成,在胚胎发育中期,嗅球嗅鞘细胞可表达P75NTR,GFAP和s1ooβ。目的观察嗅鞘细胞经脊髓移植后对SOD1G93A转基因ALS大鼠发病时间,生存率,行为学等的改善情况,探讨细胞移植对ALS治疗的可能机制,并为临床研究提供基础实验依据。方法1.mSOD1G93A转基因大鼠的鉴定出生后三周的仔鼠剪尾后提取DNA,PCR扩增。PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统下观察。2.嗅鞘细胞培养选取新生7天的SD大鼠,在超净工作台中取其嗅球,然后用眼科剪反复剪碎,剪成0.5-1.0mm3大小的组织块,将组织块移入离心管内,培养液,用弯头吸管来回轻轻吹打组织块,制成细胞悬液,胰蛋白酶消化后收集细胞,以20%的血清培养基制成细胞悬液平均铺入细胞培养板中,在CO2培养箱中培养。3.嗅鞘细胞移植大鼠麻醉后,将大鼠俯卧于手术台上,定位,摘除脊髓T6后半段和T8前半段椎板。将吸取细胞的微量注射器置于立体定位仪上,定位后下针,注射位点为胸段(T7)脊髓后索。4.临床评估及斜板实验所有实验动物自100天起进行观察。观察的指标分别为发病时间,生存时间,体重及斜板实验。5.组织切片及神经元计数所有实验动物分别于干预后2周(114天)及4周(128天)进行组织学检测。取材部位为T6-T8段脊髓,免疫染色及神经元计数的组织做冠状切片,荧光细胞追踪所用组织做矢状切片。将干预后四周取材的T6-T8段脊髓的冠状切片做尼氏染色,以计算各实验组的神经元数量。显微镜下观察尼氏染色后的脊髓前角细胞,记录细胞形态完整的脊髓前角细胞数量。6.免疫荧光组织化学干预后四周取材的冰冻切片做ChAT及NF免疫组织化学染色。将需要染色的冰冻切片置于37℃的恒温烤箱中复温2小时后,将冰冻切片置于摇床上,PBS清洗三次,每次10min；封闭液孵育2小时。加入以封闭液配置一抗4℃孵育过夜。37℃复温30min后,加入PBS冲洗三次,每次10min。滴加二抗(R488,1：400),室温孵育45min。细胞核染色,用Hoechst 33342(1：1000)染细胞核1min。PBS清洗后水性封片剂封片,待观察。7.蛋白免疫印迹将动物处死后迅速取材,取所需要的组织提取蛋白,测定蛋白浓度后上样,进行SDS凝胶电泳。电泳结束后选取所需蛋白条带转膜,封闭杂交后,在暗房中X光片曝光,凝胶图像分析仪扫描所得图像,条带光密度由QuantityOne软件分析获得。结果1.嗅鞘细胞鉴定及移植后嗅鞘细胞的迁徙细胞移植入SOD1G93A大鼠脊髓胸段(T7)移植两周后,绿荧光蛋白的嗅鞘细胞在SOD1G93A大鼠的脊髓处呈弥散状态分布。移植后四周,表达绿荧光蛋白的嗅鞘细胞弥散到更远的距离,细胞在移植位点两侧的迁徙长度为8.4mm。2.临床评估及行为学实验嗅鞘细胞移植组的ALS大鼠与未移植组和培养基注射组相比,没有显著性差异,四肢出现异常的平均时间均为105天左右。而嗅鞘细胞移植组在生存时间及病程中的作用显著,均优于各对照组。在发病后7-10天时(出生134-137时),OEC移植组大鼠的体重及斜板实验的结果与各对照组之间均显示出显著性差异。3.运动神经元定性及定量胸段脊髓的前角神经元尼氏染色及神经元脊髓显示,与野生型大鼠相比较,SOD1转基因大鼠在发病后运动神经元大量死亡,并有显著性差异(p<0.001)。接受OEC移植的SOD1G93A转基因大鼠的运动神经的死亡数量远少于未移植组及培养基注射组。ChAT的免疫组织化学的染色结果与尼氏染色的结果一致。4.蛋白免疫印迹OEC细胞移植组的ChAT蛋白水平远低于野生的阳性对照组大鼠,但高于未经治疗的SOD1G93A组和培养基注射组,并有显著性差异。而培养基注射组的ChAT蛋白水平和SOD1G93A组无显著性差异(p<0.01)5.嗅鞘细胞的中枢神经成鞘作用细胞移植部位取材,组织固定后做冰冻纵切。NF染色,与GFP标记的细胞形成双染,可在共聚焦下观察到OEC形成髓鞘化修复。结论嗅鞘细胞移植改善了转基因SOD1G93A大鼠的运动功能,延长了其生存时间。移植后的嗅鞘细胞不仅可以迁移至远离移植位点8.4mm的区域,同时还可以抑制运动神经元的死亡,促进髓鞘化修复和神经纤维再生。

全文目录

实验一人胚胎嗅球嗅鞘细胞的培养及免疫组织化学表型鉴定  3-37
  中文摘要  3-5
  英文摘要  5-8
  符号说明  8-9
  前言  9-11
  材料与方法  11-18
  结果  18-26
  讨论  26-31
  结论  31-32
  参考文献  32-37
实验二嗅鞘细胞移植对Msod1~(G93A)ALS大鼠治疗研究  37-79
  中文摘要  37-40
  英文摘要  40-43
  符号说明  43-44
  前言  44-45
  材料与方法  45-56
  结果  56-67
  讨论  67-73
  结论  73-74
  参考文献  74-79
致谢  79-80
攻读学位期间发表的学术论文  80-81

嗅鞘细胞表型特性和对mSOD1~（G93A）ALS大鼠的治疗研究

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