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MiR-16调控蜕膜间充质干细胞的作用机制

作　者: 王亚平
导　师: 侯亚义
学　校: 南京大学
专　业: 生理学
关键词: 间充质干细胞 重度子痫前期 miR-16 microRNA芯片
分类号: R714.245
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究首先比较分析了重度子痫前期(severe pre-eclmapsia,sPE)和正常人母胎界面来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)中差异表达的microRNAs。其次,对microRNAs芯片结果进行了生物信息学分析,发现miR-16在该实验中具有重要的生物学意义。最后,证实了高表达的miR-16可抑制正常蜕膜MSC的增殖活性和其对血管新生的调控功能,这些功能都与sPE的发生有着密切的联系；提示miRNAs对母胎界面MSC的功能调控可能是对sPE发病机制的一种新见解。1、母胎界面蜕膜MSC分离技术的完善间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一类具有未分化特性,低免疫原性,能高效率自我更新的干细胞。母胎界面是MSC的一个重要来源,并且母胎界面处相关功能的改变：如螺旋动脉重铸障碍,滋养层细胞浸润过浅,免疫平衡失调等都会影响妊娠的正常进行。为此,母胎界面处的MSC对于正常的妊娠过程可能具有重要的调节功能。目前已知的从组织中分离MSC的方法都必须先将组.织消化成单细胞悬液,而我们选取的MSC分离来源蜕膜组织,很难用传统的胶原酶消化,再者使用长时间的消化,又可能影响细胞的活性,造成了从蜕膜中获得MSC比较困难。因此,寻找更好的蜕膜MSC分离方法势在必行。我们尝试结合传统的细胞贴壁分离法和组织块贴壁分离法,使用一种半贴壁的分离方式,成功有效地获得大量的蜕膜MSC(dMSC)。处理24小时内可以观察到贴壁的成纤维样的细胞形态,贴壁细胞一周内分裂增殖并成漩涡状生长。我们检测了培养后第三代MSC的表型。蜕膜MSC高表达CD29, CD44, CD90, CD105(SH2), CD73(SH3)和HLA-ABC,但是不表达CD19, CDllb, CD14,CD34和CD31(上皮细胞标志)和HLA-DR,和报道的其它来源的MSC具有一样的表面标记表型。2、正常人与sPE病人母胎界面蜕膜MSC中microRNAs的差异表达我们使用同样的方法获取了sPE病人母胎界面蜕膜来源的MSC,并且发现与正常dMSC相比sPE病人的dMSC表现出较低的增殖活性,但表面标记表型没有发生变化。有研究表明sPE病人与正常人母胎界面MSC表达不同的细胞因子。这些现象都说明在sPE患者母胎界面,MSC存在着功能异常,这种MSC的功能改变是如何发生的?MicroRNAs (miRNAs)的发现是近年重大的科学突破之一,它是一种短(19-25核苷酸)的单链非编码RNA,通过和mRNA3’端非翻译区结合调节目的基因的表达水平。MiRNAs的差异表达或遗传改变都会影响它们与靶基因的结合,涉及许多疾病的发病机制。我们前期研究发现与正常人相比sPE患者母胎界面处的胎盘组织中存在差异表达的miRNAs。无独有偶,很多文献也有类似的报道。这提示我们sPE患者母胎界面处的MSC中是否出现了差异表达的miRNA。我们使用miRNA芯片技术和q-PCR实验方法检测了20例正常孕妇蜕膜来源MSC和20例sPE病人蜕膜MSC中差异表达的miRNA。并对其芯片结果做了进一步的验证,同时我们还对其进行了生物信息学分析,结果发现在microRNA-GO-network和microRNA-Gene-network的分析中,miR-16具有最高degree,提示miR-16在该实验中具有重要的生物学意义。3、MiR-16调控MSC的机制为此,我们研究了miR-16对dMSC的调控功能,并预测和验证了miR-16调控dMSC相关功能对应的靶基因。我们把用于高低表达miR-16的片段pre-miRNA16分子以及anti-miR-16inhibitor利用Lipofectamine2000转入dMSC,结果发现,在dMSC细胞中高表达miR-16,会抑制dMSC的增殖活性,引起dMSC的G0/G1期阻滞并且抑制其对血管新生的调节功能。为了研究miR-16调控dMSC的作用机制,我们使用计算机预测miR-16的相关靶基因,并且结合生物信息学分析,发现miR-16靶向调控细胞周期相关的周期蛋白CCNE1和血管生成相关的VEGF-A分子。我们进一步采用q-PCR和Western blot实验验证了高表达的miR-16降低了MSC中CCNE1和VEGF-A分子mRNA和蛋白的表达水平;而相应luciferase荧光报告基因实验也证实miR-16可直接结合到CCNE1和VEGF-A的3’UTR。综上所述,miR-16的过表达抑制MSC的增殖活性,引起细胞周期的阻滞；高表达miR-16的MSC抑制了HUVEC的成血管能力,抑制了内皮细胞的迁移能力,这些功能的改变都与sPE的发生有着密切的联系。提示,在sPE病人蜕膜MSC中差异表达的miRNAs可能会调控母胎界面蜕膜MSC的正常生理功能进而影响sPE的发生。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-12
缩略词表  12-14
前言  14-16
第一章 母胎界面蜕膜MSC的分离和培养  16-24
  1.1 引言  16
  1.2 实验材料  16-17
    1.2.1 实验对象  16-17
    1.2.2 主要试剂  17
    1.2.3 主要仪器和设备  17
  1.3 实验方法  17-19
    1.3.1 符合实验标准的蜕膜组织的筛选获取  17-18
    1.3.2 蜕膜组织间充质干细胞的分离培养及纯化  18
    1.3.3 分别统计绘制正常人和重度子痫前期病人dMSC的生长曲线  18
    1.3.4 分别检测正常人和重度子痫前期病人dMSs的细胞周期  18-19
  1.4 实验结果与分析  19-23
    1.4.1 成功获取蜕膜来源MSC  19-20
    1.4.2 与正常dMSC相比sPE病人dMSC的细胞形态和表面标志分子没有发生改变  20-21
    1.4.3 与正常dMSC相比sPE病人dMSC表现出较低的增殖活性,并出现细胞周期的阻滞  21-23
  1.5 讨论  23-24
第二章 重度子痫前期病人母胎界面蜕膜MSC中microRNAs的差异表达  24-35
  2.1 引言  24
  2.2 实验材料  24-25
    2.2.1 实验对象  24
    2.2.2 主要试剂  24-25
    2.2.3 主要仪器设备  25
  2.3 实验方法  25-28
    2.3.1 细胞microRNA抽提和鉴定  25
    2.3.3 实时定量PCR(real-time PCR)  25-28
  2.4 实验结果与分析  28-33
    2.4.1 重度子痫前期蜕膜来源MSC中差异表达的microRNAs  28-29
    2.4.2 microRNAs芯片结果的生物信息学分析  29-33
    2.4.3 实时定量PCR验证microRNAs芯片结果  33
  2.5 讨论  33-35
第三章 miR-16抑制dMSC的增殖和血管调节功能  35-56
  3.1 引言  35
  3.2 实验材料  35-37
    3.2.1 实验对象  35-36
    3.2.2 主要试剂  36
    3.2.3 主要仪器设备  36-37
  3.3 实验方法  37-42
    3.3.1 蜕膜来源间充质干细胞的分离及纯化  37
    3.3.2 microRNA的转染及检测  37-38
    3.3.3 Q-PCR检测microRNA的表达  38
    3.3.4 Q-PCR分析靶基因的mRNA水平  38-39
    3.3.5 Western blot检测蛋白表达  39-40
    3.3.6 ELISA检测不同转染组MSC培养上清中的VEGF表达  40-41
    3.3.7 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡  41
    3.3.8 CCK-8法检测细胞活力  41
    3.3.9 细胞周期的检测  41-42
    3.3.10 内皮细胞成血管实验  42
    3.3.11 内皮细胞迁移能力检测(transwell法)  42
  3.4 实验结果与分析  42-54
    3.4.1 高表达的miR-16抑制dMSC的增殖活性  42-44
    3.4.2 miR-16不影响dMSC的凋亡和表型  44-45
    3.4.3 高表达的miR-16引起dMSC细胞周期的阻滞  45-47
    3.4.4 高表达miR-16的dMSC抑制了滋养层细胞的迁移能力和HUVEC的成血管功能  47-48
    3.4.5 转染miR-16后其靶基因的表达  48-50
    3.4.6 CCNE1是miR-16引起dMSC周期阻滞的关键靶点  50-51
    3.4.7 VEGFA在miR-16抑制dMSC的血管调控功能中起关键作用  51-52
    3.4.8 CCNE1和VEGFA在正常人和sPE病人dMSC中的差异表达  52-53
    3.4.9 miR-16表达与CCNE1、VEGFA表达的相关性分析  53-54
  3.5 讨论  54-56
结论  56-57
参考文献  57-60
附录  60-63
硕士期间科研成果  63-65
致谢  65-66

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠） > 妊娠中毒症 > 子痫
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