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Wnt1在卵巢癌SKOV3细胞系干细胞中的作用机制

作　者: 王丽霞
导　师: 李连宏
学　校: 大连医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: Wnt1 β-catenin CD133 卵巢癌 干细胞 shRNA 载体 SKOV3细胞 Wnt1-shRNA 卵巢癌干细胞 Sox2
分类号: R737.31
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


卵巢癌是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，发病率呈上升的趋势。虽然诊断方法得到不断的改进，但是卵巢癌易复发、并且伴随着转移和多药耐药性的出现，影响到卵巢癌的治疗效果。因为发病机制到目前为止还不十分清楚，使卵巢癌的预防和诊疗水平的提高受到了限制。所以，进一步研究卵巢癌发生、发展、耐药复发机制，有助于寻找有效的抑制卵巢癌增殖的治疗方法，也是提高卵巢癌患者生存率的关键。干细胞能较长时间存活，这使得它们更易在增殖和分化的过程中发生基因突变。越来越多的研究表明肿瘤是一种干细胞疾病，肿瘤起源于肿瘤干细胞（tumourstem cell TSCs），在干细胞在自我更新过程中很可能因为出现基因突变，从而使细胞生长失控，导致肿瘤发生。自我复制、较长的寿命、抗凋亡信号通路的激活和端粒酶活性等是肿瘤细胞干细胞的重要特征。“肿瘤干细胞”假说认为：虽然在肿瘤组织中肿瘤干细胞只占有极少的比例，可是这些高致瘤性的细胞却最大可能是肿瘤发生、复发、转移和治疗失败的根源。Wnt信号通路作用广泛且复杂，一方面负责动物发育模式的调控，另一方面在调控干/祖细胞的正常生长和内外环境稳定方面具有重要作用，在许多实体肿瘤的发生过程中均检测到与这一通路的异常激活有关。Dishevelled (DSH)位于细胞膜上，是相关Wnt受体复合物的主要成分，Wnt蛋白与其结合后被激活，从而抑制下游蛋白质复合物，包括axin、GSK-3与APC蛋白。此三种蛋白形成axin/GSK-3/APC复合体，促进细胞内信号分子β-catenin的降解。而当抑制β-catenin降解复合物，可使细胞胞浆内的β-catenin得以稳定存在，一部分β-catenin进入细胞核，通过TCF/LEF转录因子家族使得某些特定基因得以表达。有关Wnt信号通路在卵巢发育及卵巢癌发生发展中的确切作用机制还不十分清楚，但现有的研究结果表明Wnt信号通路活化与肿瘤耐药、肿瘤干细胞的维持以及与其他信号通路相互作用等有关，了解Wnt在卵巢肿瘤发生及恶性进展中的作用将为卵巢癌的防治提供新的靶标。本实验首先从卵巢癌SKOV3细胞系中分选出以CD133+为标记的卵巢癌细胞，检测Wnt1信号通路分子在CD133+细胞和CD133-细胞中的表达情况，了解Wnt信号通路在卵巢癌干细胞中的作用。其次，用表达Wnt1shRNA的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo稳定转染SKOV3细胞，诱导Wnt1基因沉默，研究Wnt1基因下调后对不同标记卵巢癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，探讨其在卵巢癌发生发展中的作用，从而为卵巢癌的防治提供新的靶标。第一部分Wnt1在卵巢癌SKOV3细胞系干细胞中的表达及其作用机制目的：了解Wnt1在卵巢癌干细胞中的表达和作用。方法：采用免疫磁珠法从无血清培养的卵巢癌悬浮细胞中分选CD133+细胞和CD133-细胞。采用real-time RT-PCR技术检测Wnt1和β-catenin的mRNA和蛋白在CD133+细胞和CD133-细胞中的表达情况。结果：分选出的CD133+细胞约占细胞总数的7.25%，分选出的CD133+细胞表达干细胞标志蛋白CD133和Oct-4。Wnt1和β-catenin的mRNA及蛋白在CD133+细胞中的表达量与CD133-细胞中的表达量相比,均有显著性增加(P均＜0.05)。结论：在CD133+细胞中，Wnt1可能处于活化状态，活化的Wnt1可能有助于CD133+细胞形态及功能的维持。第二部分RNAi沉默Wnt1基因对卵巢癌SKOV3细胞影响的研究目的：探讨Wnt1基因表达在卵巢癌发生发展中的作用。方法：设计Wnt-shRNA，用于干扰并下调卵巢癌中目的基因的表达。以脂质体LipofectamineTM2000介导转染卵巢癌SKOV3细胞。转染后48h，采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中Wnt1基因mRNA的转录水平，筛选有效的Wnt1shRNA质粒，Western blot检测Wnt1蛋白在卵巢癌SKOV3细胞中的表达。结果：4个Wnt1shRNA表达载体Wnt1-shRNA-1、Wnt1-shRNA-2、Wnt1-shRNA-3和Wnt1-shRNA-4经测序鉴定证明插入正确。转染48h后，在SKOV3细胞中Wnt1shRNA-1组、Wnt1shRNA-2组、Wnt1shRNA-3组、Wnt1shRNA-4组、空白对照组、阴性对照组的标化Wnt1mRNA水平分别为0.77±0.07、0.98±0.08、0.71±0.05、0.57±0.05、0.96±0.08、1.01±0.08，与Control组相比，Wnt1-shRNA-1、Wnt1-shRNA-2、Wnt1-shRNA-3、Wnt1-shRNA-4组Wnt1mRNA表达量均下降（p均<0.05），其中转染Wnt-shRNA-4的SKOV3细胞中Wnt1-mRNA表达水平低于Wnt1shRNA-1、Wnt1-shRNA-2、Wnt1-shRNA-3组（p=0.007,0.002,0.046）。Wnt1-shRNA-4干扰抑制效率为64.3%。Western blot可检测到Wnt1蛋白在SKOV3中的表达，干扰片段Wnt1-shRNA-4的抑制效果较好。结论：载体构建成功，shRNA可明显下调Wnt1mRNA和蛋白在SKOV3表达。第三部分Wnt1siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞系干细胞增殖机制的研究目的：探讨下调Wnt1基因表达后卵巢癌干细胞增殖的机制方法：通过筛选得到稳定下调Wnt1的卵巢癌SKOV3细胞，克隆形成实验和CCK8实验检测干扰Wnt1表达对卵巢癌的增殖作用，流式细胞仪检测转染前后细胞周期的改变，AV/PI双染检测shRNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞诱导的凋亡情况。流式细胞仪法检测shRNA干扰后CD133+卵巢癌干细胞比例，Western blot检测Wnt1、β-catenin、Sox2及CD133蛋白的表达水平。结果：下调Wnt1表达后，对SKOV3细胞增殖抑制作用明显， G2/M期细胞增多；下调Wnt1的表达后， SKOV3凋亡细胞的比例增加。SKOV3细胞系中CD133+卵巢癌干细胞在卵巢癌细胞中的比例下降，Wnt1，Sox2及CD133蛋白的表达降低。结论：下调Wnt1可以抑制SKOV3细胞的增殖促进细胞凋亡，使细胞停滞在G2/M期。Sox2可能位于卵巢癌Wnt1信号通路的下游，通过下调Wnt1蛋白的表达，抑制Sox2转录作用，抑制卵巢癌干细胞的增殖。

全文目录


摘要  9-12
Abstract  12-16
第一部分 Wnt1 在卵巢癌 SKOV3 细胞系干细胞中的表达及其作用机制  16-33
  （一） 前言  16-17
  （二） 材料和方法  17-24
    1. 试验材料  17-20
      1.1 细胞株  17
      1.2 主要试剂和仪器  17-19
      1.3 主要试剂的配置  19-20
    2. 方法  20-23
      2.1 细胞培养  20
      2.2 免疫磁珠筛选  20
      2.3 细胞免疫组化  20-21
      2.4 细胞 RNA 抽提  21-22
      2.5 RT-PCR  22-23
      2.6 Western blot 检测  23
    3. 统计学处理  23-24
  （三） 结果  24-25
    1. CD133+细胞分选  24
      1.1 卵巢癌悬浮细胞球形成  24
      1.2 CD133+细胞分选结果  24
    2. Wnt1 及β-catenin mRNA 在各组细胞中表达情况  24-25
    3. Wnt1 及β-catenin 蛋白在各组细胞中表达情况  25
  （四） 讨论  25-28
  （五） 结论  28-29
  （六） 参考文献  29-33
第二部分 RNAi沉默Wnt1 基因对卵巢癌SKOV3细胞影响的研究  33-55
  （一） 前言  33-34
  （二） 材料和方法  34-44
    1. 实验材料  34-37
      1.1 质粒、菌株及细胞株  34
      1.2 主要试剂与仪器  34-35
      1.3 主要试剂配制  35-37
    2. 方法  37-44
      2.1 SKOV3 细胞培养  37-38
      2.2 shRNA 寡核苷酸的合成  38
      2.3 shRNA 寡核苷酸链的退火  38-39
      2.4 Wnt1 shRNA 载体的构建和鉴定  39-41
      2.5 转染和筛选  41-42
      2.6 实时荧光定量 RT-PCR  42
      2.7 Western blot 分析  42-44
    3. 统计学处理  44
  （三） 结果  44-46
    1. shRNA 的质量检测  44
    2. Wnt1 shRNA 真核表达载体的构建及测序鉴定  44-45
    3． Wnt1 shRNA 对 SKOV3 细胞中 Wnt1 mRNA 表达的抑制作用  45-46
    4. Western blot 法检测转染后 Wnt1 蛋白的表达  46
  （四） 讨论  46-50
  （五） 结论  50-51
  （六） 参考文献  51-55
第三部分 Wnt1 siRNA 抑制卵巢癌 SKOV3 细胞系干细胞增殖机制的研究  55-72
  （一） 前言  55-56
  （二） 材料和方法  56-59
    1. 主要材料  56
    2. 方法  56-59
      2.1 单克隆增殖实验和 CCK8 法检测对细胞增殖能力的影响  56-57
      2.2 流式细胞技术检测对细胞周期的影响  57
      2.3 流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响  57
      2.4 流式细胞仪检测 CD133+细胞比例  57
      2.5 蛋白提取及定量  57-58
      2.6 Western blot 步骤  58-59
    3. 统计学处理  59
  （三） 结果  59-63
  （四） 讨论  63-67
  （五） 结论  67-68
  （六） 参考文献  68-72
综述  72-91
  参考文献  80-91
英文缩写  91-92
就读期间发表论文  92-93
致谢  93-94

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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