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下调N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V对前列腺癌细胞放射治疗和激素治疗敏感性的影响

作　者: 黄惠怡
导　师: 张健
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: GnT-V 前列腺癌 放射敏感性 激素敏感性 细胞周期 凋亡 信号通路
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


一、研究背景前列腺癌是发生在男性中最常见的恶性肿瘤之一,并且随着年龄的增长,其发病率越来越高。据报道,在20世纪80年代晚期以及90年代早期,美国新诊断的前列腺癌病例已超过肺癌作为男性中发病率最高的的肿瘤疾病[1]。目前,前列腺癌的常见治疗方法包括：根治性的手术、放疗、内分泌治疗、化疗等。放射治疗作为传统治疗手段之一,广泛应用于不同分期的前列腺癌：早期前列腺癌的放射治疗可以达到根治的目的,效果与根治性手术相似；局部晚期前列腺癌采取放疗结合内分泌治疗可提高存活率[2]；有远处转移者,姑息放疗可以缓解局部症状,改善生活质量。但临床发现部分病人因放疗抵抗导致放疗后局部复发,预后不佳[3]。提高放射剂量可以减低肿瘤局部复发率,但是高剂量放疗伴随的副反应,如肠道损伤、泌尿系统受损、性功能障碍等,却严重影响患者的生活质量[4]。此外,内分泌治疗是晚期前列腺癌姑息治疗的主要方法,虽然最初可获得很高的有效率,但是相当一部分病人在治疗2-5年后病情进展为激素抵抗性前列腺癌(HRPC),最终导致治疗失败。长时间内分泌治疗诱导肿瘤细胞产生激素抵抗性的同时,对放射治疗的耐受性同样得到提高[5]。因此,如何提高前列腺癌放射治疗以及激素治疗敏感性成为治疗前列腺癌亟须解决的一个问题。生物体内的大多数蛋白质都是以糖蛋白的形式存在,而细胞表面糖蛋白寡糖链的结构重塑对糖蛋白功能起重要的作用,已发现,这些寡糖链与细胞的分化、粘附、增殖、肿瘤的侵袭和转移密切相关。而寡糖链的产生、结构的改变是通过糖基转移酶介导。越来越多的证据表明,与糖基转移酶基因的变化可以直接影响肿瘤组织细胞表型发生转变。糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-V, GnT-V)为糖蛋白N-糖链加工酶之一,主要分布在高尔基体中,其作用为决定N-糖链类型及复杂型糖链结构,催化形成N-糖链的p-1,6分支。已发现GnT-V对肿瘤的生长、转移起重要作用。在许多恶性肿瘤组织中GnT-V呈现高表达,提示不良的预后,如乳腺癌、结肠癌和肝癌。GnT-V影响肿瘤生物活性主要是通过改变β-1,6分支结构从而上调EGFR信号通路,抑制蛋白酶体的降解,抑制E-cadherin/β-catenin复合物功能,最终促进肿瘤的生长和转移。尽管目前很多实验表明GnT-V和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是尚未有研究报导GnT-V和前列腺癌之间的关系。在本实验中,我们主要关注GnT-V的表达是否影响前列腺癌的生物学行为,并进一步探讨其相关的内在机制。二、研究目的此前,本课题组通过体内、外实验,比较干扰GnT-V表达前后PC3细胞的增殖、凋亡情况,发现下调GnT-V表达可以增加激素非依赖型前列腺癌细胞株PC3的放射敏感性,并进一步研究其中可能涉及的相关机制。但是GnT-V表达与激素依赖型前列腺癌细胞的放射敏感性是否存在同样关联却未被研究。在本实验中,我们利用shRNA,构建低表达GnT-V的激素依赖型前列腺癌细胞株Lncap GnT-V/1079以及Lncap GnT-V/1564。通过体内及体外实验对比正常的Lncap细胞和低表达GnT-V的Lncap细胞的放射敏感性差异。另外,本实验还进一步探讨GnT-V与前列腺癌细胞(Lncap, PC3)激素治疗敏感性的关系。最后,通过细胞周期、凋亡蛋白家族、细胞信号通路方面研究GnT-V影响前列腺癌细胞放射敏感性、激素敏感性的内在机制。三、实验方法1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定：由上海吉玛公司完成。2、细胞培养及转染人前列腺癌细胞株Lncap在37℃5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代1-2次。Lncap细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入Lncap细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。3、干扰效果检测(1) RT-PCR测定GnT-V mRNA用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA. GnT-V上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA3’.使用GAPDH作为内参,上游引物为5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3’下游引物为5’AGGGGCCATCCACAGTCTTC3’.反应条件为：95℃预变性30s, PCR:95℃5s,64℃34s,共40个循环,溶解曲线：95℃0s,63℃60s,95℃0s.基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct(C为Cycle,t为threshold)值,ACT代表目的基因相对于内参基因的表达强度,公式为ACT=Ct目的基因-Ct内参基因。用Folds=2-AACt表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系,AACt=ACT实验组-ACT对照组。目的基因为GnT-V,内参基因为GAPDH.(2) Western blot检测GnT-V蛋白表达提取总蛋白,测定总蛋白浓度,吸取40pg总蛋白,去离子水补至20gL,加入1/4体积5xSDS上样buffer煮沸5min,离心后吸取15μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h, TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)、HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相对表达量。4、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对前列腺癌细胞株Lncap放射敏感性的影响(体外实验)(1)平板克隆形成实验检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对Lncap细胞照射后克隆形成能力的影响取各组对数生长期的待测细胞,接种于6孔板,每孔200个细胞,24h后分别给予OGy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy五个剂量点照射,然后置于37℃5%CO2条件下静止培养3周,待出现肉眼可见克隆时,终止培养,加入0.1%结晶紫染色,计数。通过克隆数计算出细胞生存分数。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组,Lncap GnT-V/1079组和Lncap GnT-V/1564组,每组重复例数为9。(2)CCK-8法测定pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA干扰后对Lncap细胞单次6Gy照射后增殖能力的影响。取各组对数生长期的待测细胞,消化,制备单细胞悬液,计数,以每孔5×103个细胞接种到96孔板中,每组细胞6个复孔,铺5块板,置于37℃5%CO2条件下静止培养,24h后给予6Gy照射。照射后不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)分别用CCK-8法检测各组细胞活力。测量各组的OD450nm值,绘制生长曲线,并计算干扰组的生长抑制率。细胞生长抑制率(IR)=(对照组OD450值—干扰组OD450值)/对照组OD450值×100%。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组,Lncap GnT-V/1079组和Lncap GnT-V/1564组,每组重复例数为18。(3)划痕实验检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对Lncap、PC3细胞单次6Gy照射后迁移能力的影响。取各组对数生长期的待测细胞,接种到6孔板中,每孔5×105个细胞,置于37℃5%CO2条件下静止培养,待细胞融合率达100%时划痕,并给予6Gy照射。照射后不同时间点(0h、12h、24h、48h)在同一位置拍照,并用Image-ProPlus6.0软件测量划痕距离,计算划痕愈合率。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组,Lncap GnT-V/1079组和Lncap GnT-V/1564组：PC3组,PC3GnT-V/NC组,PC3GnT-V/1079组和PC3GnT-V/1564组。每组重复例数为9。(4) Hoechst33258核染色及流式细胞术检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对Lncap细胞照射前后凋亡的影响。取对数生长期的细胞,分别给予0Gy及6Gy照射,72h后移去培养基,用1RPBS洗2次,4%多聚甲醛液室温固定20min,移去固定液,用PBS清洗2次,然后室温孵育终浓度1ug/ml的Hoechst33258染色液5分钟。孵育完毕后用PBS简单清洗2次,吸尽液体,滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片。然后在荧光显微镜下观察细胞核形态。实验分为Lncap组Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组,每组重复例数为9。取对数生长期的细胞,分别给予0Gy及6Gy照射,72h后消化细胞,1RPBS洗3遍,取1×105个细胞,加入195μL Annexinv PE结合液重悬细胞,再加入5μLAnnexinv PE和1μL7-AAD轻轻混匀,室温避光孵育10分钟。1000rpm/min离心5分钟,弃上清,加入200μL Annexinv PE结合液重悬细胞,流式细胞仪检测。实验分为Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(5)比色分析法测定Caspase-3活性取对数生长期的细胞,分别给予6Gy照射,24、48、72h后,消化离心,PBS洗1次,离心,吸尽上清,按每200万细胞加入100ul裂解液的比例加入预冷的裂解缓冲液冰上裂解细胞15min,期间涡旋振荡3-4次,每次10s。4℃14000Rg离心15min,收集上清测定蛋白浓度。取适量的待测样品与Caspase-3底物DEVD-PNA以及检测缓冲液混合,37℃孵育1-2h至颜色变化明显,用96孔板在酶标仪405nm比色。PBS作为阴性对照组。干扰组样品OD(405nm)值与对照组样品OD(405nm)值的比值为Caspase-3活性的百分率。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(6)流式细胞术检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰对Lncap细胞照射后周期的影响。取各组对数生长期的待测细胞,分别给予OGy,2Gy,6Gy,10Gy照射,24h后消化细胞,1×PBS洗3遍,取1×106个细胞,加入2m1于-20℃预冷的70%乙醇,4℃冰箱过夜。染色前用PBS离心沉淀去除固定液,冷PBS洗2次。加入100μLRNA酶RNaseA,37℃水后冰上终止RNaseA作用。每ml细胞悬液加入50μg/ml碘化丙啶PI染色液100μL混匀,37℃避光15min。流式细胞仪检测。实验分为Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(7) Western blot检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA对Lncap细胞照射前后凋亡相关蛋白的改变。提取总蛋白,测定蛋白浓度,吸取40μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入5μL5×SDS上样buffer煮沸5min,离心后吸取15μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用羊抗人bax蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人bcl-xl蛋白单克隆抗体(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)、 HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,mage-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值,用bax/GAPDH代表bax的相对表达量,bcl-2/GAPDH代表bcl-2的相对表达量,bcl-xl/GAPDH代表bcl-xl的相对表达量。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组,每组重复例数为3。(8)双荧光素酶实验测定pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对Lncap、PC3细胞照射前后NF-kB信号通路的改变。取对数生长期的待测细胞,消化、计数,铺24孔板,每孔1×105个细胞,置于37℃5%CO2条件下静止培养。24h后行细胞转染(0.9ug的PNF-kB-LUC+0.05ug PRL-CMV)。转染后24h给予6Gy照射,照射后0h、6h行双荧光素酶实验,计算各组萤火虫荧光值F/海肾荧光值。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组；PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组。每组重复例数为9。5、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对前列腺癌细胞株Lncap放射敏感性的影响(体内实验)(1)裸鼠成瘤实验5周龄BALB/c裸鼠,雄性。每组各16只。细胞重悬于PBS,调整细胞浓度为5×107/ml,按100gL/只进行臀部皮下注射。当肿瘤体积达200-300mm3,给予2Gy照射连续5天。照射后每隔3d测量肿瘤体积,按V=0.5ab2(V代表肿瘤体积,a为长径,b为短径)绘制生长曲线,并记录裸鼠生存时间。(2)生存分析每组取10只裸鼠,记录每只裸鼠的生存天数。(3)免疫组化石蜡切片脱蜡和水化后,对组织抗原进行相应的修复。切片加内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育5分钟,加动物非免疫血清,室温下孵育10分钟。除去血清,每张切片加一滴一抗(GnT-V蛋白多克隆抗体(1：200)、Bax单克隆抗体(1：200)、Bcl-2多克隆抗体(1：200)、Bcl-xl多克隆抗体(1：200)),4℃冰箱过夜,PBS液冲洗。之后切片滴加生物素标记的二抗,室温下孵育30分钟,PBS液冲洗。每张切片加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温下孵育10分钟。冲洗后滴新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察。蒸馏水冲洗,苏木素复染,沥干1分钟后流水冲洗,盐酸酒精分化,流水冲洗,烤干,封片。6、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对前列腺癌细胞株Lncap、PC3激素治疗敏感性的影响。(1)CCK-8法测定pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对Lncap、PC3细胞氟他胺作用后增殖能力的影响。取各组对数生长期的待测细胞,消化,制备单细胞悬液,计数,以每孔5×103个细胞接种到96孔板中,每组细胞6个复孔,置于37℃5%CO2条件下静止培养,24h后更换含不同浓度氟他胺(Oumol/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/l)的完全培养基。72h后分别用CCK-8法检测各组细胞活力。测量各组的OD450nm值,计算干扰组的生长抑制率。细胞生长抑制率(IR)=(对照组OD450值—干扰组OD450值)／对照组OD450值×100%。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组；PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组。每组重复例数为18。(2) Western blot检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA对Lncap、PC3细胞氟他胺作用前后凋亡相关蛋白的改变。提取总蛋白,测定蛋白浓度,吸取40μg总蛋白,用PBS补至20μL,加入5μL5×SDS上样buffer煮沸5mmin,离心后吸取15μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人bcl-xl蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人bax蛋白单克隆抗体(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:1000)、 HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值,用bax/GAPDH代表bax的相对表达量,bcl-2/GAPDH代表bcl-2的相对表达量,bcl-xl/GAPDH代表bcl-xl的相对表达量。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组；PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组。每组重复例数为3。(3)双荧光素酶实验测定pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA对Lncap、PC3细胞氟他胺作用前后WNT信号通路的改变。取对数生长期的待测细胞,消化、计数,铺24孔板,每孔1×105个细胞,置于37℃5%C02条件下静止培养。24h后行细胞转染(0.9ug的PTCF4-LUC+0.05ug PRL-CMV)。转染后24h更换含10umol/l的完全培养基培养,加药后0h、72h行双荧光素酶实验,计算各组萤火虫荧光值F/海肾荧光值。实验分为Lncap组,Lncap GnT-V/NC组和Lncap GnT-V/1079组；PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组。每组重复例数为9。7、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。所给数据为均数±标注差。以P<0.05表示有统计学意义。实时定量RT-PCR、Western-Blot实验结果多组比较采用方差分析,多重比较采用LSD法。平板克隆实验、CCK8细胞增殖实验、划痕实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验、双荧光素酶实验多组比较采用析因设计的方差分析,组内多重比较采用LSD法,两组间的比较采用两独立样本t检验。Caspase-3活性检测实验采用两独立样本t检验。其中Western-Blot、实时定量RT-PCR则取三次实验结果的平均值,将实验组换算成对照组的相对百分数进行统计。参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验Welch法。皮下成瘤试验瘤体体积采用重复测量的方差分析,组内比较采用one-way ANOVA分析,组内的多重比较采用LSD法,两组间的比较采用两独立样本t检验；三组生存时间的比较采用Kaplan-Merer法分析。四、结果1、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。另外,质粒中的Neo基因同时赋予转染细胞G418抗性。因此,通过脂质体Lipofectamine2000TM将含有GnT-V shRNA的质粒导入Lncap细胞后,在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,并且可在含G418培养基中稳定传代,说明稳定转染成功。2、干扰效果检测实时定量PCR实验结果得出Lncap GnT-V/1079和Lncap GnT-V/1564组细胞GnT-V基因的mRNA表达较Lncap、Lncap GnT-V/NC组明显降低,表明转染GnT-VshRNA载体能抑制目的基因mRNA表达；Western blot结果也显示转染GnT-VshRNA载体能抑制GnT-V蛋白表达。Image-Pro Plus6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示Lncap GnT-V/1079、 Lncap GnT-V/1564组mRNA水平的抑制率分别为74%和64.3%,蛋白水平的抑制率分别为68.7%和54.7%,与Lncap、Lncap GnT-V/NC组相比均有统计学意义(P<0.001)。3、GnT-V shRNA对细胞放疗前后增殖、迁移能力的影响(1)、以细胞在不同照射剂量(OGy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的克隆形成率绘制细胞生存率曲线,Lncap GnT-V/1079及Lncap GnT-V/1564组的生存率较Lncap组及Lncap GnT-V/NC组低,说明下调GnT-V的表达可进一步抑制Lncap细胞放疗后的克隆形成能力。(2)、以细胞在6Gy放疗后不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)绘制细胞生长曲线,Lncap GnT-V/1079及Lncap GnT-V/1564组的生长抑制率较Lncap组及Lncap GnT-V/NC组高,可见下调GnT-V的表达可增强放疗对Lncap细胞的生长增殖抑制作用。由于在既往实验中,本实验组尚未研究GnT-V的表达与PC3细胞放疗后迁移能力之间的关系,因此补充划痕实验,分析GnT-V shRNA对Lncap、PC3细胞照射后迁移能力的改变。(3)、以细胞在6Gy放疗后不同时间点(0h、12h、24h、48h)测量划痕距离,Lncap GnT-V/1564及Lncap GnT-V/1079的划痕愈合率较Lncap组及Lncap GnT-V/NC组低；PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079的划痕愈合率较PC3组及PC3GnT-V/NC组低,可见下调GnT-V的表达可进一步抑制PCa细胞放疗后的迁移能力。由于在检测细胞增殖、迁移能力实验上,Lncap GnT-V/1079及Lncap GnT-V/1564均较对照组Lncap及Lncap GnT-V/NC低,而Lncap GnT-V/1079与Lncap GnT-V/1564细胞之间的差别无统计学意义,但是Lncap GnT-V/1079细胞GnT-V干扰效率更高,因此选择Lncap GnT-V/1079细胞进行后续实验。4. GnT-VshRNA对细胞放疗前后凋亡的影响Hoechst33258核染色及流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD法测定放射前后各组Lncap细胞的凋亡。结果显示,放射治疗前Lncap GnT-V/NC组、Lncap GnT-V/1079组细胞的凋亡率分别为：(1.30+0.26)%、(3.15±0.56)%；放射治疗后Lncap GnT-V/NC组、Lncap GnT-V/1079组细胞的凋亡率分别为：(9.66+0.73)%、(12.38+0.82)%。说明下调GnT-V可提高Lncap细胞放疗后的凋亡率。5. GnT-VshRNA增加细胞放疗敏感性可能涉及的机制(1)、以细胞在6Gy放疗后不同时间点(0h、24h、48h、72h)检测各组细胞的caspase-3活性,Lncap GnT-V/1079组均高于Lncap、Lncap GnT-V/NC组,可见下调GnT-V的表达可通过增加caspase-3活性从而提高Lncap细胞的放射敏感性。(2)、以细胞在不同剂量(0Gy,2Gy,6Gy,10Gy)照射后检测各组细胞周期比例,可见Lncap GnT-V/NC组细胞照射后出现明显G2/M阻止；Lncap GnT-V/1079组细胞照射后G2/M期阻止不明显,推测下调GnT-V的表达通过打破Lncap细胞放疗诱导的G2/M期阻止从而增加放疗敏感性。(3)、以细胞在6Gy照射前后检测凋亡相关蛋白表达水平,实验结果表明,Lncap GnT-V/1079组细胞在放射治疗前后Bax表达量均高于Lncap及Lncap GnT-V/NC组；Bcl-2表达量均低于Lncap及Lncap GnT-V/NC组；Bcl-xl三组无明显差别。可见下调GnT-V的表达通过增加Bax/Bcl-2比例增加Lncap细胞的放疗敏感性。(4)、以细胞在6Gy照射前后检测NF-kB信号通路表达水平,Lncap GnT-V/1079组细胞在放射治疗前萤火虫荧光值F/海肾荧光值低于Lncap及Lncap GnT-V/NC组,放射治疗后进一步增加与对照组的差距；PC3GnT-V/1079组细胞在放射治疗后萤火虫荧光值F/海肾荧光值低于PC3及PC3GnT-V/NC组,放射治疗后进一步增加与对照组的差距。可见下调GnT-V的表达可通过阻断NF-kB信号通路从而增强PCa细胞的放疗敏感性。6、GnT-VshRNA对裸鼠皮下成瘤实验的影响(1)、X线照射后,Lncap GnT-V/1079肿瘤体积增长较Lncap和Lncap GnT-V/NC速度慢,差异显著。Lncap GnT-V/1079组裸鼠生存期较Lncap和Lncap GnT-V/NC长。(2)、免疫组化实验示：Bcl-2表达于胞浆及细胞核中,Lncap GnT-V/1079表达量低于Lncap GnT-V/NC;Bax表达于胞浆,Lncap GnT-V/1079表达量高于Lncap GnT-V/NC; Bcl-xl表达于胞浆,Lncap GnT-V/1079及Lncap GnT-V/NC表达量无明显差异。(3)、从各组肿瘤组织中提取蛋白,行western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平,实验结果显示与Lncap及Lncap GnT-V/NC组相比,Lncap GnT-V/1079组表达Bax较高、Bcl-2较低、Bcl-xl无明显差异。此前,本实验研究组主要关注GnT-V与前列腺癌放射敏感性之间的关系,但是其与前列腺癌激素敏感性的关系尚未研究,因此,本实验探讨GnT-V的表达能否影响PCa细胞(Lncap, PC3)激素敏感性,并从凋亡蛋白表达、细胞信号通路方面讨论其中内在机制。7、GnT-V shRNA对细胞激素治疗敏感性的影响以细胞在不同浓度氟他胺(Oumol/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/l)作用后72h检测各组细胞活力,计算生长抑制率,Lncap GnT-V/1079的生长抑制率均较Lncap组及Lncap GnT-V/NC组高,PC3GnT-V/1079的生长抑制率均较PC3组及PC3GnT-V/NC组高,可见下调GnT-V的表达可增加PCa的激素敏感性。8. GnT-VshRNA增加细胞激素敏感性可能涉及的机制(1)、以细胞在10umol/l氟他胺作用24h后提取蛋白,检测凋亡相关蛋白表达水平,实验结果表明,Lncap GnT-V/1079组细胞在药物作用前后Bax表达量均高于Lncap及Lncap GnT-V/NC组；Bcl-2表达量均低于Lncap及Lncap GnT-V/NC组；Bcl-xl三组无明显差别；PC3GnT-V/1079组细胞在药物作用前后Bax表达量均高于PC3及PC3GnT-V/NC组；Bcl-2表达量均低于PC3及PC3GnT-V/NC组；Bcl-xl三组无明显差别；可见下调GnT-V的表达通过增加Bax/Bcl-2比例增加PCa细胞的激素敏感性。(2)、以细胞在10umol/l氟他胺作用前后检测WNT信号通路表达水平,结果发现Lncap GnT-V/1079组细胞在氟他胺作用前后萤火虫荧光值F/海肾荧光值均低于Lncap及Lncap GnT-V/NC组；PC3GnT-V/1079组细胞在氟他胺作用前后萤火虫荧光值F/海肾荧光值均低于PC3及PC3GnT-V/NC组,可见下调GnT-V的表达可通过阻断WNT信号通路从而增加PCa细胞的激素敏感性。五、结论1、靶向GnT-V的shRNA真核表达质粒可以显著下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。2、下调GnT-V的表达可以提高PCa细胞的体外、体内放射敏感性。3、下调GnT-V的表达提高PCa细胞放射敏感性的机制可能是通过抑制NF-kB信号通路表达,从而解除放疗诱导的G2/M期阻止以及影响凋亡相关蛋白的表达。4、下调GnT-V的表达可以提高PCa细胞的体外激素敏感性。5、下调GnT-V的表达提高PCa细胞激素敏感性的机制可能是通过阻断WNT信号通路,从而影响凋亡相关蛋白的表达。6、该GnT-V的shRNA序列可能成为前列腺癌放疗、激素治疗增敏靶点。

全文目录


摘要  3-16
ABSTRACT  16-30
第一章 前言  30-32
第二章 材料与方法  32-49
  2.1 实验材料  32
    2.1.1 细胞株  32
    2.1.2 质粒  32
    2.1.3 主要试剂及耗材  32
    2.1.4 主要仪器  32
  2.2 实验方法  32-49
    2.2.1 细胞培养与转染  32-33
    2.2.2 RT-PCR测定GnT-V mRNA  33-36
    2.2.3 Western blot检测蛋白表达  36-40
    2.2.4 平板克隆实验检测细胞克隆形成率  40
    2.2.5 CCK-8检测细胞增殖性  40-41
    2.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力  41-42
    2.2.7 Hoechst 33258核染色及流式细胞术检测细胞凋亡  42-43
    2.2.8 比色分析法测定Caspase-3活性  43-44
    2.2.9 流式细胞术检测细胞周期  44
    2.2.10 双荧光素酶实验检测细胞信号通路2.2.10.1实验分组  44-45
    2.2.11 皮下成瘤实验  45-46
    2.2.12 免疫组化检测种植瘤切片GnT-V、Bcl-2、Bcl-xl、Bax表达情况(切片制作)  46-48
    2.2.13 统计学分析  48-49
第三章 结果  49-83
  3.1 重组质粒的稳定转染  49
  3.2 干扰效果检测  49-50
  3.3 GnT-V shRNA对放疗前后细胞克隆形成的影响  50-54
  3.4 CCK-8法测定GnT-V shRNA对放疗后细胞增殖能力变化  54-56
  3.5 划痕实验检测GnT-V shRNA对Lncap细胞照射前后迁移能力改变  56-60
  3.6 Hoechst 33258核染色及流式细胞术检测GnT-V shRNA对Lncap细胞照射前后凋亡改变  60-62
  3.7 比色分析法检测GnT-V shRNA对细胞放疗后Caspase-3活性的影响  62
  3.8 流式细胞术检测GnT-V shRNA对Lncap细胞照射前后周期改变  62-65
  3.9 双荧光素酶实验检测GnT-V shRNA对PCa细胞照射前后NF-kB信号通路改变  65-67
  3.10 GnT-V shRNA对裸鼠皮下成瘤实验的影响  67-70
  3.11 生存曲线  70
  3.12 Western blot检测GnT-V shRNA对Lncap细胞照射前后相关凋亡蛋白的改变  70-73
  3.13 CCK-8法测定GnT-V shRNA对激素治疗后PCa细胞增殖能力变化  73-76
  3.14 Western blot检测GnT-V shRNA对PCa细胞氟他胺作用前后相关凋亡蛋白的改变  76-80
  3.15 双荧光素酶实验检测GnT-V shRNA对PCa细胞氟他胺作用前后WNT信号通路表达的改变  80-83
第四章 讨论  83-87
第五章 结论  87-88
参考文献  88-92
致谢  92-93

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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