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BMP信号对大鼠脊髓神经胶质细胞发育及功能的影响

作　者: 范春玲
导　师: 罗学港
学　校: 中南大学
专　业: 生物学
关键词: 骨形态发生蛋白 脊髓 星形胶质细胞 少突胶质细胞 OPCs 基因敲除 BMPR1A 髓鞘形成 脊髓损伤 胶质增生 胶质限制性前体细胞
分类号: R651.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一章BMP信号通路主要分子在胚胎后期及出生后大鼠脊髓神经胶质细胞的表达目的观察BMP信号通路上的主要分子在胚胎后期及出生后大鼠脊髓神经胶质细胞的表达情况。方法取不同发育时期Fisher344大鼠的脊髓,包括胚胎18天(E18)、出生0、7、14、21、28、56天。用免疫组织化学方法检测蛋白BMP,受体BMPR和下游分子pSmad1/5/8在不同时期脊髓少突胶质细胞(Oligodendrocytes, OLs)和星形胶质细胞(Astrocytes, AST)的表达变化。结果1.胚胎E18天：此时间点脊髓内尚未探测到APC标记的成熟OLs,GFAP标记的AST也不多见。受体BMPR IA主要出现在中央管周围和白质边缘软膜下3CB2阳性的放射状胶质细胞上。配体BMP2和下游分子pSmad1/5/8主要出现在灰质神经元内,中央管周围部分细胞上也有表达。2.出生0-7天：脊髓内OLs和AST的数量明显增多。受体BMPR IA主要表达在3CB2阳性和3CB2/GFAP双阳性细胞上,信号强度随着时间的推移而降低；同时在脊髓其它部位的细胞上逐渐出现表达,但强度较弱。此时期BMP2和pSmad1/5/8在脊髓内的表达强度明显提高,主要位于OLs和神经元内,部分AST也有表达。3.出生7-21天：BMPRIA、BMP2和pSmad1/5/8均在OLs上高表达,其中BMPRIA在P14-P21天时甚至转移到细胞核内,呈现过表达状态。各分子在AST上表达复杂：其中BMP2表达于白质大部分AST内,且强度较高；BMPRIA则仅在少量细胞上微弱表达；pSmad1/5/8除在软膜下区的AST内表达较强外,其它部位的表达均较弱。4.P28-成年：各分子在AST和OLs的表达明显下调,成年后保持在较低的水平。结论1.出生到成年是大鼠脊髓神经胶质细胞成熟和功能完善的主要时期,BMP信号通路的重要成员此时在OLs和AST上均呈现高表达,说明该信号通路在大鼠脊髓神经胶质细胞发育过程中发挥重要作用；2.BMP信号各分子在成年大鼠脊髓OLs和部分AST上依然有一定程度表达,提示其可能参与成年脊髓内神经胶质细胞功能的维持。第二章BMP信号干预对胶质细胞发育的影响目的通过体外和体内多种方式对BMP信号进行干预后,观察胶质细胞发育受到的影响。方法体外部分：取出生3-5天大鼠脊髓,分离培养少突胶质前体细胞(OPCs)。分别通过细胞外增加BMP蛋白浓度和感染携带抑制型Smad蛋白的腺病毒在细胞内阻断通路的方式干预BMP信号转导,用免疫细胞化学和western-blot方法检测信号干预对细胞分化、成熟和髓鞘形成的影响。体内部分：在少突胶质系细胞上敲除BMPR1A,免疫组织化学和原位杂交观察在体干扰BMP信号对脊髓OLs系分化和成熟的影响。结果体外部分：加入BMP4蛋白增加细胞外配体浓度,当BMP4浓度为0.1ng/ml时,OPCs分化为01阳性OLs的百分比与常规分化组对比无显著差异；随着加入BMP4蛋白浓度的升高,OPCs分化为01阳性OLs的百分比逐渐下降,而形成AST的比例随之升高。感染携带Smad6或Smad7的病毒从细胞内阻断BMP通路,常规分化培养后OPCs分化为O1阳性OLs的百分比与正常对照组和病毒对照组对比无明显差异；但细胞MBP蛋白的含量降低；把感染病毒的OPCs与脊髓背根节(DRG)经元共培养,发现Smad6或Smad7组包裹轴突形成髓鞘样结构的细胞数量明显少于正常对照组和病毒对照组。体内部分：选择性敲除BMPR1A后,动物脊髓内olig2标记或PDGFRα mRNA标记的OPCs数量和分布情况均未发生明显改变；而MBP或MBPmRNA染色的阳性细胞数或阳性面积在出生0天明显低于未敲除组的动物；7天时,这种差异依然存在,但已不如0天明显。结论1.增加细胞外BMP配体浓度主要促进前体细胞向AST分化,抑制OLs的形成。2.从细胞内干扰或阻断BMP信号正常转导阻碍OLs成熟,同时还影响其形成髓鞘的能力。第三章BMP诱导的不同亚型AST对神经元存活及突起生长的影响目的通过观察BMP诱导的不同亚型AST对神经元存活及突起生长的影响,分析AST在脊髓损伤中发挥双重作用的可能原因及机制。方法体外分离培养胚胎大鼠脊髓来源的胶质限制性前体细胞(GRPs)和成年大鼠脊髓来源的OPCs,用BMP4诱导分别分化形成Ⅰ型和Ⅱ型AST。Western blot方法检测各细胞表达纤维粘连蛋白(FN)的情况。把两种AST分别与DRG神经元共培养18hr后,免疫细胞化学方法染色,计数DRG神经元的存活个数,测量其突起长度,并进行比较分析。结果免疫荧光染色发现,Ⅰ型AST内FN表达强度明显高于其前体细胞GRPs(微弱表达),而Ⅱ型AST及其前体细胞OPCs内均未探及FN信号;Western blot检测也出现类似结果：Ⅰ型AST内FN蛋白含量很高,GRPs虽有蛋白条带,但非常微弱,而Ⅱ型AST及OPCs内不能看到明显的FN蛋白条带。把各种细胞分别与DRG神经元共培养18hr,细胞计数和突起长度测量结果显示：Ⅰ型AST共培养组神经元的存活个数最多,神经元突起长度也明显大于其余各组；而Ⅱ型AST共培养组的存活神经元个数和突起长度甚至低于其前体细胞OPCs共培养组。结论BMP蛋白诱导不同前体细胞生成两种不同亚型的AST,Ⅰ型AST在促进神经元存活和突起生长的作用上均明显优于Ⅱ型,这可能与它们表达不同的因子如FN有关。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-12
目录  12-14
1 绪论  14-16
2 BMP信号通路主要分子在胚胎后期及出生后大鼠脊髓神经胶质细胞的表达  16-38
  2.1 材料和方法  19-21
    2.1.1 主要的仪器设备与试剂  19
    2.1.2 实验动物  19-20
    2.1.3 组织处理  20
    2.1.4 免疫组织化学检测  20-21
    2.1.5 图像处理  21
  2.2 实验结果  21-36
    2.2.1 BMP受体在不同发育阶段大鼠脊髓神经胶质细胞的表达  21-22
    2.2.2 BMP蛋白在不同发育阶段大鼠脊髓神经胶质细胞的表达  22-23
    2.2.3 BMP下游活化分子pSmad 1/5/8在不同发育阶段大鼠脊髓神经胶质细胞的表达  23-25
    附图  25-36
  2.3 讨论  36-37
    2.3.1 BMP信号转导通路主要相关分子在OLs系的表达变化  36
    2.3.2 BMP信号转导通路主要相关分子在AST系的表达变化  36-37
  2.4 小结  37-38
3 BMP信号干预对胶质细胞发育的影响  38-73
  3.1 材料和方法  39-47
    3.1.1 主要的仪器设备与试剂  39-41
    3.1.2 细胞培养及细胞处理  41-43
    3.1.3 实验动物  43
    3.1.4 实验分组  43-44
    3.1.5 免疫组织化学  44
    3.1.6 免疫细胞化学  44
    3.1.7 Western-Blot  44-45
    3.1.8 PCR鉴定  45-46
    3.1.9 原位杂交检测  46-47
    3.1.10 数据收集及处理  47
  3.2 结果  47-69
    3.2.1 BMP信号通路主要相关分子在出生后大鼠脊髓来源的OPCs及其分化形成的OLs上的表达概况  47-48
    3.2.2 增加细胞外BMP蛋白浓度对OLs分化及成熟的影响  48-49
    3.2.3 细胞内阻断BMP信号对OLs分化及成熟的影响  49-50
    3.2.4 细胞内阻断BMP信号对OLs形成髓鞘的影响  50
    3.2.5 BMPR IA条件敲除对小鼠脊髓内OPCs的影响  50-51
    3.2.6 BMPR IA条件敲除对小鼠脊髓内OLs的影响  51-52
    附图  52-69
  3.3 讨论  69-72
    3.3.1 细胞外干预BMP浓度对OLs分化及成熟的影响  69
    3.3.2 细胞内干预BMP信号对OLs分化及成熟的影响  69-70
    3.3.3 细胞内干预BMP信号对OLs形成髓鞘的影响  70
    3.3.4 选择性敲除BMPR IA对OLs发育的影响  70-72
  3.4 小结  72-73
4 BMP诱导生成的不同亚型AST对神经元存活及突起生长的影响  73-85
  4.1 材料和方法  74-77
    4.1.1 主要仪器设备及试剂  74
    4.1.2 细胞培养及细胞处理  74-76
    4.1.3 免疫细胞化学  76
    4.1.4 Western-blot  76
    4.1.5 数据收集和处理  76-77
  4.2 结果  77-82
    4.2.1 BMP诱导GRPs生成Type 1A/GDA,OPC生成Type 2A/ODA  77
    4.2.2 BMP诱导GRPs或OPC生成的GDA或ODA对神经元存活的影响  77
    4.2.3 BMP诱导GRPs或OPC生成的GDA或ODA对共神经元突起生长的影响  77-78
    4.2.4 BMP诱导GRPs分化形成的GDA表达促神经生长的纤维粘连蛋白(FN)  78
    附图  78-82
  4.3 讨论  82-84
  4.4 小结  84-85
结论  85-86
参考文献  86-94
综述  94-106
  参考文献  99-106
攻读学位期间主要的研究成果  106-108
致谢  108

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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