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工程菌表达可溶性半夏凝集素及其活性研究

作　者: 许韶威
导　师: 徐涛
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PTA P-D1 P-D2 MTT Hoechst染色 SUMO 毕赤酵母
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

半夏凝集素（Pinellia ternata agglutinin, PTA）是从传统中药半夏块茎中分离得到的一种活性物质，在分类上属于单子植物甘露聚糖结合凝集素，可以凝集兔血细胞、鼠血细胞，但不能凝集人血细胞，对多种肿瘤细胞如卵巢癌、结肠癌、肝癌等都有比较好的抑制效果，是一类发展前景较好的的潜在抗肿瘤活性成分。而从天然半夏凝集素受半夏块茎的产量限制，且有周期性，限制了以后大规模的开发和应用。故部分研究者选择工程菌表达半夏凝集素，以期获得与天然半夏凝集素功能相近的表达产物。在以往的凝集素表达研究中，课题组选用了原核表达系统以及家蚕杆状病毒表达系统成功地表达了半夏凝集素，但仍存在表达产物为包涵体、纯化不易、表达周期过长、不适宜工业化生产等问题。本研究首次采用人源SUMO融合表达系统成功地表达了可溶的三叶半夏凝集素C端结构域（P-D2）以及首次采用毕赤酵母表达系统表达了可溶的三叶半夏凝集素N端结构域（P-D1）。本研究分别构建了原核表达载体pET-32-SUMO-P-D2以及真核穿梭质粒pPIC9k-P-D1，分别地转入到原核表达菌株BL21(DE3)以及酵母表达菌株SMD1168并成功地筛选到了阳性的表达菌株，经IPTG以及甲醇诱导表达后，表达出带有His标签的可溶的SUMO-P-D2蛋白（His标签在SUMO蛋白N端，P-D2蛋白上无His标签）以及P-D1蛋白。其中SUMO-P-D2蛋白经SUMO蛋白酶酶切后重新镍柱上样获得纯度超过95%的P-D2蛋白，产量在5mg/L左右，P-D2蛋白经镍柱纯化同样可获得，产量在12mg/L左右。凝血实验选用小鼠红细胞，天然半夏凝集素在4μg/mL时可以观察到较好的凝血现象。当P-D1以及P-D2的浓度为6μg/mL时，才可以观察到较好的凝血现象。天然半夏凝集素、P-D1以及P-D2蛋白都可以和D-甘露聚糖发生结合反应,最低抑制浓度分别为0.56mM0.05、0.67mM0.12以及0.63mM0.05，而不能和D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖发生反应。抗真菌实验显示，P-D1蛋白同天然半夏凝集一样对细交链孢菌有比较好的抑制效果。体外抗肿瘤活性实验显示P-D1以及PTA对所选用的肿瘤细胞系（肝癌Bel-7404、结肠癌SW-620、肝癌SMMC-7721）都有比较好的抑制其增殖活性。Bel-7404肝癌细胞的24h以及48h的MTT实验显示，P-D1以及PTA蛋白对Bel-7404细胞作用效果呈现出浓度依赖以及时间依赖特点。P-D1蛋白对SW-620也有良好的抑制效果且为浓度依赖，但对同样是肝癌SMMC7721抑制不是浓度依赖，且抑制效果不如对其他两种细胞系的抑制效果。P-D2对Bel-7404以及SW-620这两种细胞都表现出良好的抑制其增殖的效果。其中P-D2蛋白对肝癌Bel-7404的抑制效果明显优于对结肠癌SW-620的抑制效果（p＜0.05）。P-D1蛋白以及P-D2蛋白抑制相同的癌细胞的效果没有明显的差异（P＞0.05）。在Hoechst染色观察凋亡观察实验中，可以明显地观察到这三种凝集素蛋白引起的凋亡现象，其中浓度高的、时间长的实验组观察到的现象更明显。本实验选用的两种表达系统均成功表达可溶性的三叶半夏凝集素，说明了这两种表达系统在表达凝集素蛋白上具有一定的应用前景。这为其它凝集素的工程菌表达提供了一定的参考。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语  12-17
第一章文献综述  17-30
  1 凝集素的概论  17-25
    1.1 凝集素的分类  17-20
    1.2 凝集素的生物特性  20-23
      1.2.1 凝集素凝集特性  20-21
      1.2.2 凝集素诱导肿瘤细胞产生凋亡和自噬  21-22
      1.2.3 凝集素的抗病毒特性  22
      1.2.4 凝集素的其他特性  22-23
    1.3 凝集素的应用  23-25
      1.3.1 凝集素在基础研究领域的应用  23-24
      1.3.2 凝集素在肿瘤领域的应用  24
      1.3.3 凝集素在转基因植物领域的应用  24-25
  2 毕赤酵母表达系统概论  25-28
    2.1 毕赤酵母表达系统的优势  25
    2.2 毕赤酵母表达的载体和菌株  25-27
      2.2.1 毕赤酵母表达质粒的一般特征  26
      2.2.2 毕赤酵母表达菌株  26-27
    2.3 毕赤酵母外源基因表达优化策略  27-28
      2.3.1 载体改造以及外源基因优化策略  27
      2.3.2 菌株选择以及培养条件优化策略  27-28
  3 人源 SUMO 融合系统促蛋白可溶表达  28-29
    3.1 融合表达系统的简述  28
    3.2 SUMO 融合表达系统  28-29
  4 本研究的目的和意义  29-30
第二章人源 SUMO 促半夏凝集素的表达纯化及活性初步研究  30-53
  前言  30-31
  1 实验材料和方法  31-44
    1.1 实验材料  31
    1.2 实验方法  31-44
      1.2.1 载体 pET-32-SUMO-P-D2 的构建与鉴定  31-37
        1.2.1.1 pEasyT1-pta 质粒以及 pET-32-SUMO 质粒的提取  31-32
        1.2.1.2 三叶半夏凝集 C 端结构域基因序列的获取  32-34
        1.2.1.3 pET-32-SUMO-P-D2 载体转化及阳性克隆筛选、鉴定  34-37
      1.2.2 BL21(DE3)表达菌株的构建以及表达  37-39
      1.2.3 SUMO 融合系统表达的蛋白 SUMO-D2 的分离纯化  39
      1.2.4 SUMO 酶酶切蛋白 SUMO-D2 以及蛋白 P-D2 的分离纯化  39-41
      1.2.5 P-D2 蛋白凝血活性实验以及糖结合特异性实验  41-42
      1.2.6 MTT 法检测 P-D2 蛋白的抗肿瘤活性  42-43
      1.2.7 Hoechst 33342 染色观察肿瘤细胞凋亡现象  43-44
  2 实验结果  44-50
    2.1 三叶半夏凝集素 C 端结构域基因序列的获得  44
    2.2 载体 pET-32-SUMO-P-D2 的鉴定  44-45
    2.3 SUMO-D2 融合蛋白表达以及分离纯化  45-46
    2.4 SUMO-D2 融合蛋白酶切以及 P-D2 分离纯化  46-47
    2.5 P-D2 蛋白凝血活性实验以及糖结合特异性实验  47-48
    2.6 P-D2 蛋白体外抗肿瘤活性实验  48-49
    2.7 Hoechst 33342 染色观察肿瘤细胞凋亡现象  49-50
  3 讨论  50-52
  4 本章小结  52-53
第三章毕赤酵母表达三叶半夏凝集素及其活性研究  53-72
  前言  53
  1.材料与方法  53-63
    1.1 实验材料  53-54
    1.2 实验方法  54-63
      1.2.1 载体 pPIC9k-P-D1 的构建与鉴定  54-58
        1.2.1.1 pEasyT1-pta 质粒以及 pPIC9k 质粒的提取  54
        1.2.1.2 三叶半夏凝集 N 端结构域基因序列的获取  54-55
        1.2.1.3 pPIC9k-P-D1 载体的转化及阳性克隆的筛选、鉴定  55-58
      1.2.2 阳性 SMD1168 菌株的构建以及筛选  58
        1.2.2.1 SMD1168 菌株的分离鉴定  58
        1.2.2.2 SMD1168 菌株感受态的制备  58
      1.2.3 pPIC9k-P-D1 载体电转进入到 SMD1168 菌株  58-59
        1.2.3.1 pPIC9k-P-D1 质粒的线性化  58-59
        1.2.3.2 电转操作步骤  59
      1.2.4 SMD1168 菌株转化子的筛选与鉴定  59-61
      1.2.5 阳性 SMD1168 菌株的诱导表达鉴定  61
      1.2.6 三叶半夏凝集素 N 端结构域的表达纯化  61-62
      1.2.7 天然三叶半夏凝集素的提取  62-63
      1.2.8 P-D1 蛋白的凝血活性以及糖结合特异性实验  63
      1.2.9 P-D1 抗真菌活性实验  63
      1.2.10 P-D1 体外抗肿瘤活性实验  63
      1.2.11 P-D1 诱导 Bel-7404 细胞凋亡现象观察实验  63
  2 实验结果  63-70
    2.1 载体 pPIC9k-P-D1 的构建与鉴定  63-64
    2.2 阳性 SMD1168 菌株的鉴定与表达纯化  64-67
    2.3 P-D1 蛋白的凝血活性以及糖特异性实验  67
    2.4 重组蛋白 P-D1 抗真菌活性实验  67-68
    2.5 P-D1 体外抗肿瘤活性实验  68-69
    2.6 P-D1 诱导 Bel-7404 细胞凋亡现象观察实验  69-70
  3 讨论  70-71
  4 本章小结  71-72
结论  72-73
参考文献  73-80
硕士期间发表论文  80-81
致谢  81

工程菌表达可溶性半夏凝集素及其活性研究

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