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意大利工蜂上颚腺10-HDA合成的蛋白质组学研究

作　者: 张翔
导　师: 李丕武；杨晓慧
学　校:
专　业: 轻工技术与工程
关键词: 意大利工蜂 10-HDA 分泌规律双向电泳质谱
分类号: S891
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是一种反式不饱和脂肪酸，是蜂王浆中主要活性成分之一，具有抗菌、免疫调节及抗肿瘤等多种重要的生理功能。10-HDA主要分泌于蜜蜂工蜂的上颚腺，但其生物合成的机理目前还不清楚。我们通过分析工蜂上颚腺10-HDA分泌规律，应用比较蛋白质组学的方法对不同日龄工蜂上颚腺的差异蛋白进行分离和鉴定，筛选生物合成10-HDA的相关蛋白,初步揭示10-HDA生物合成的分子机制，为利用分子生物学、基因工程等技术提高10-HDA产量提供理论依据。本文以山东长清蜂场意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂为实验动物，通过高效液相色谱法（HPLC）分别检测0、5、10、15、20、25、30日龄工蜂头部10-HDA含量，研究随着日龄的增加10-HDA的分泌规律。从0日龄到30日龄，10-HDA分泌量逐渐增加，20到25日龄增加最快，0日龄最低，为0.53±0.33μg/只；25日龄最高，为69.72±5.46μg/只。冬季和夏季10-HDA分泌规律相一致，且冬季工蜂10-HDA分泌量比夏季对应日龄工蜂分泌量高。本文通过检测上颚腺和去除上颚腺的工蜂头部10-HDA含量，进一步证实10-HDA来源于工蜂上颚腺。根据工蜂上颚腺10-HDA的分泌规律，选择10-HDA分泌量差异显著的0日龄（最低）与25日龄（最高）工蜂，首先通过扫描电镜观察0日龄和25日龄工蜂上颚腺形态，发现0日龄的上颚腺呈液泡状，未成“V”形，易破，有光泽，而25日龄上颚腺明显呈“V”形，是无光泽的组织实体，乳白色或暗灰色，25日龄的腺体比0日龄大且饱满。通过双向电泳技术分离0日龄与25日龄上颚腺差异蛋白，并进行质谱鉴定。结果分离和鉴定出29个差异蛋白点，分子量大部分在20~70kD之间，主要是酸性蛋白，碳水化合物和能量代谢相关蛋白占44.83%，外源蛋白类占13.79%，蛋白折叠类占10.34%，转录与翻译类、细胞骨架类、抗氧化类和发育蛋白类均占6.90%，未知蛋白3.45%。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第1章绪论  11-25
  1.1 10-HDA 概述  11-15
    1.1.1 10-HDA 来源  11
    1.1.2 10-HDA 结构及理化性质  11-12
    1.1.3 10-HDA 生理活性  12-13
    1.1.4 10-HDA 生物合成途径  13-15
  1.2 意大利蜜蜂简介  15-18
  1.3 蛋白质组学及其研究技术  18-21
    1.3.1 蛋白质组与蛋白质组学  18-19
    1.3.2 蛋白质组学研究技术  19-20
    1.3.3 蛋白质组学在蜜蜂中的应用  20-21
  1.4 本课题研究内容及意义  21-25
    1.4.1 立题背景及其研究意义  21-22
    1.4.2 研究内容  22-25
第2章意大利工蜂头部 10-HDA 分泌规律研究及其合成部位验证  25-39
  2.1 引言  25
  2.2 实验试剂  25-26
    2.2.1 主要试剂  25-26
    2.2.2 试剂的配制  26
  2.3 实验器材  26
  2.4 实验方法  26-28
    2.4.1 意大利蜜蜂的标记和采集  26
    2.4.2 头部 10-HDA 的提取  26-27
    2.4.3 10-HDA 的高效液相色谱（HPLC）检测  27
    2.4.4 10-HDA 的气相色谱-质谱（GC-MS）检测  27
    2.4.5 冬季不同分工外勤蜂上颚腺 10-HDA 含量比较  27
    2.4.6 10-HDA 合成部位的验证  27-28
  2.5 结果  28-36
    2.5.1 精密度（Precision）检验  28-29
    2.5.2 稳定性(Stability)检验  29
    2.5.3 回收率（Recovery）检测  29-30
    2.5.4 高效液相色谱法(HPLC)检测 10-HDA  30
    2.5.5 气相色谱-质谱（GC-MS）检测 10-HDA  30-32
    2.5.6 不同日龄意大利工蜂 10-HDA 含量变化规律  32-33
    2.5.7 冬季不同分工外勤蜂上颚腺 10-HDA 含量比较  33-34
    2.5.8 10-HDA 含量频率分布检测  34-35
    2.5.9 10-HDA 合成部位的验证  35-36
  2.6 讨论  36-37
  2.7 本章小结  37-39
第3章 10-HDA 合成相关蛋白的分离与鉴定  39-67
  3.1 引言  39
  3.2 实验试剂和材料  39-43
    3.2.1 实验动物  39-40
    3.2.2 主要试剂  40
    3.2.3 试剂的配制  40-42
    3.2.4 主要器材  42-43
  3.3 实验方法  43-50
    3.3.1 采集方法  43-44
    3.3.2 意大利工蜂上颚腺的解剖  44
    3.3.3 上颚腺形态研究  44
    3.3.4 上颚腺蛋白的提取  44
    3.3.5 上颚腺蛋白浓度测定  44-45
    3.3.6 意蜂工蜂上颚腺蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  45-46
    3.3.7 双向电泳分离不同日龄工蜂上颚腺差异蛋白  46-49
    3.3.8 图谱扫描及图像分析  49
    3.3.9 胶内酶解  49-50
    3.3.10 肽混合物脱盐  50
    3.3.11 质谱鉴定差异蛋白  50
    3.3.12 蛋白质鉴定  50
  3.4 结果  50-61
    3.4.1 意大利工蜂上颚腺形态  50-53
    3.4.2 不同匀浆时间对工蜂上颚腺蛋白含量提取的影响  53-54
    3.4.3 各日龄意大利工蜂上颚腺蛋白含量变化  54-55
    3.4.4 上颚腺蛋白 SDS-PAGE 电泳  55-56
    3.4.5 不同日龄工蜂上颚腺 2-DE 图谱  56-58
    3.4.6 10-HDA 合成相关蛋白的质谱鉴定  58-59
    3.4.7 10-HDA 合成相关蛋白的分类  59-61
  3.5 讨论  61-65
    3.5.1 脂肪酸代谢类  61
    3.5.2 碳水化合物和能量代谢类  61-63
    3.5.3 蛋白质折叠类  63-64
    3.5.4 转运蛋白和调控因子  64-65
    3.5.5 外源蛋白  65
  3.6 本章小结  65-67
第4章结论与展望  67-69
  4.1 结论  67
  4.2 展望  67-69
参考文献  69-75
致谢  75-77
硕士期间发表论文  77

意大利工蜂上颚腺10-HDA合成的蛋白质组学研究

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