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与雌激素受体2mRNA3’端非翻译区特异性结合蛋白的功能研究

作　者: 戚玺君
导　师: 赵辅昆
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ERβmRNA 3’UTR RBPs RNA沉降表达调控质谱 vigilin
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

ERβ属于核受体超家族成员。研究表明,ERβ与许多恶性疾病的发生、恶变密切相关,在多种肿瘤组织细胞增殖、转移、凋亡中发挥着重要作用。同时,ERβ可能具有抑制乳腺癌发生发展的作用。通过揭示ERβ在细胞内共调分子的作用机制,可以开发出以ERβ为特异靶点的、更有效的抗癌药物。真核生物mRNA大多数的调控元件都位于非翻译序列中。这些调控元件能够通过与特定RNA结合蛋白作用,调控mRNA翻译。翻译水平的调控是真核生物基因表达调控过程中的重要环节之一,在翻译水平调控中起着重要作用的非翻译序列成为近年来基因表达调控研究的热点之一。mRNA 3’UTR不仅控制mRNA的稳定性和降解速率,而且能够调节mRNA亚细胞定位和控制mRNA的利用效率。因此进行关于ERβmRNA 3’UTR相关调控机制研究就有着重要意义。本课题结合实验室现有MALDI-TOF-TOF条件,以乳腺癌细胞MCF-7为实验对象,使用RNA沉降(RNA Pull Down)技术,从细胞总蛋白中体外筛选与ERβmRNA 3’UTR特异性结合蛋白。经过质谱鉴定得到以下七个蛋白信息:vigilin,LRP130,Splicing Factor,ILF3,KSRP,SRC homolog3和hnRNP A/B。每一个蛋白在特定的RNA代谢过程中都起着重要作用。例如,ILF3能够特异性结合富含AU序列的mRNAs,具调控基因表达的作用。vigilin是一个含有14个KH结构域的多功能蛋白,受到雌激素诱导,可能具调控ERβ表达的作用。我们以vigilin为研究对象,对其作用机制进行初步探索。通过分段转录ERβmRNA 3’UTR,结合RNA沉降技术表明vigilin主要与ERβmRNA 3’UTR的两个区域:8-207bp区域;294-430bp区域。可以认为这两个区域为vigilin调控元件所在区域。为进一步揭示vigilin调控ERβmRNA的作用机制奠定了基础。本实验中得到的其余6个蛋白对ERβmRNA有什么样的调控功能以及具体的作用机制都有待后续研究进一步揭示。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
缩略表  10-11
第一章绪论  11-19
  1. 雌激素受体研究概况  11-13
    1.1 雌激素受体  11-12
    1.2 ERβ在癌症中的作用  12-13
  2.m RNA 非翻译区研究进展  13-16
    2.1 5’端 UTR 对基因表达调控的研究进展  14-15
    2.2 3’端 UTR 对基因表达调控的研究进展  15-16
  3.R NA 结合蛋白  16-18
    3.1 RNA 结合蛋白概述  16-17
    3.2 RNA 结合蛋白的功能  17
    3.3 研究 RBPs 的方法  17-18
  4. 本课题研究的目的和意义  18-19
第二章雌激素受体βm RNA 3’UTR 特异性结合蛋白的筛选与鉴定  19-34
  1. 前言  19-20
  2. 材料和方法  20-27
    2.1 材料、试剂和仪器  20-22
      2.1.1 细胞株  20
      2.1.2 主要材料和试剂  20-21
      2.1.3 分析软件  21
      2.1.4 主要仪器  21
      2.1.5 相关溶液配置  21-22
    2.2 实验方法  22-27
      2.2.1 细胞培养和收集  22
      2.2.2 MBP-MS2 融合蛋白的表达  22-23
      2.2.3 MBP-MS2 融合蛋白的纯化  23-24
      2.2.4 RNA 体外转录  24
      2.2.5 RNA 沉降实验  24-25
      2.2.6 胶内酶解  25
      2.2.7 点靶  25
      2.2.8 MALDI-TOF-TOF 质谱鉴定和数据库搜索  25-26
      2.2.9 免疫印迹（Western Blot）  26-27
  3. 结果  27-32
    3.1 MBP-MS2 融合蛋白的表达与纯化结果  27-28
    3.2 MBP-MS2 融合蛋白与 ERβ3’UTR RNA 结合状况  28-29
    3.3 RNA 沉降实验结果  29-30
    3.4 质谱鉴定结果  30-31
    3.5 Western Blot 验证 RNA PullDown 结果  31-32
  4. 讨论  32-34
第三章 vigilin 功能初探  34-43
  1. 前言  34
  2. 材料和方法  34-36
    2.1 材料、试剂  34-35
      2.1.1 主要材料和试剂  34
      2.1.2 PCR 所用引物序列  34-35
      2.1.3 主要仪器  35
    2.2 实验方法  35-36
      2.2.1 ER βmRNA 3’UTR 分段转录载体的构建  35
      2.2.2 RNA 体外转录  35
      2.2.3 RNA 沉降实验  35
      2.2.4 免疫印迹（Western Blot）  35-36
  3. 结果  36-42
    3.1 ERβ3’UTR 部分片段载体构建结果  36-38
    3.2 ERβ3’UTR Part A 和 Part B RNA 沉降结果  38-40
    3.3 ERβ3’UTR 其他部分序列 RNA 沉降结果  40-42
  4. 讨论  42-43
第四章结论与展望  43-44
  1. 结论  43
  2. 展望  43-44
参考文献  44-49
致谢  49

与雌激素受体2mRNA3’端非翻译区特异性结合蛋白的功能研究

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