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大肠杆菌不耐热肠毒素诱导小鼠细胞因子变化规律研究

作　者: 董端凝
导　师: 刘惠莉
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT） 细胞因子 实时荧光定量PCR 巨噬细胞 液相芯片 流式细胞术
分类号: S858.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）产生的一种能导致人或幼畜肠炎和腹泻的毒性因子。是目前最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一，具有较强的免疫调节作用，可以刺激机体产生多种细胞因子。但由于其本身具有很强的肠毒性不宜直接使用，因此人们构建了许多无毒或减毒突变体，其中双突变体LTRG毒性比野生型LT低很多。本实验利用大肠杆菌表达的重组LT蛋白免疫小鼠或刺激小鼠巨噬细胞，采用建立的荧光定量PCR方法分析了LT黏膜佐剂对小鼠体内、及刺激细胞内的6种细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6动态变化。同时采用液相芯片技术及流式细胞技术，分析了LT蛋白作用下巨噬细胞内这6种细胞因子的表达及T淋巴细胞的变化。不同剂量的LTRG蛋白作用体外培养的小鼠巨噬细胞，结果1ug/ml的LTRG蛋白对巨噬细胞的刺激效果最明显，对IL-1β和IL-4细胞因子变化最显著。检测LT蛋白处理的小鼠巨噬细胞中细胞因子的mRNA表达量变化，结果显示野生型LT组IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达量分别在免疫后2h、4h和12h达到峰值，与对照组差异极显著（p＜0.01）；IL-12、IFN-γ、IL-4的mRNA表达量在免疫后24h达到最大值，与对照组差异极显著（p＜0.01）。PBS对照组细胞因子无显著变化。突变型LTRG组细胞因子mRNA的表达量在免疫后达到峰值的时间与野生型LT组相比有不同程度的延迟。为了进一步了解LTRG蛋白对共免疫原的作用，采用LTRG与BSA共免疫小鼠巨噬细胞，结果显示LTRG和BSA协同处理后大多数细胞因子的mRNA表达量在12h达到高峰，与单独使用BSA组差异极显著（p＜0.01）；TNF-α和IL-6的mRNA表达量分别在免疫后8h和24h达到峰值，与BSA组差异极显著（p＜0.01）。BSA对照组细胞因子无显著变化。通过液相芯片技术分析LT对巨噬细胞中细胞因子的影响，由于细胞上清液中蛋白含量比较低，只检测到TNF-α和IL-6的浓度，结果显示LTRG蛋白处理后TNF-α和IL-6的浓度分别在36h和48h达到最大值，与PBS对照组差异极显著（p＜0.01）；LTRG与BSA共免疫后TNF-α和IL-6的浓度在24h达到最大值，与BSA对照组差异极显著（p＜0.01）。以上结果表明LT可以激活小鼠巨噬细胞炎性反应，执行抗原递呈功能，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答，并且可以协同抗原提高免疫效果。LT免疫小鼠实验中检测发现，野生型LT和突变型LTRG蛋白组的各细胞因子分别在免疫后48h和60h左右，小鼠脾脏中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6细胞因子mRNA的表达量达到最大值，与对照组差异极显著（p＜0.01）。PBS对照组细胞因子无显著变化。表明LT及LTRG蛋白都能通过诱导细胞免疫，刺激高水平细胞因子的转录，采用流式细胞术检测LT、LTRG蛋白免疫后小鼠脾脏组织中CD4+及CD8+T淋巴细胞的变化。结果显示，LT和LTRG蛋白免疫小鼠后脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞比例相比对照组显著提高。表明，LT、LTRG刺激作用显著提高了小鼠的T淋巴细胞免疫应答能力。综上，本研究从转录和翻译水平对LT免疫后细胞、小鼠体内多个细胞因子的变化规律进行了研究，证明LTRG蛋白能够诱导Th1、Th2型细胞免疫反应，产生体液免疫和细胞免疫，产生针对LTRG蛋白抗原的非特异性免疫应答。并能提高共免疫原的免疫效果，促使机体特异性T细胞明显增多。且LTRG蛋白对Th1、Th2细胞免疫反应的促进作用优于野生型LT蛋白，但免疫应答时间迟于LT。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
引言  12-26
  1 LT 的概述  12-13
  2 LT 的基因与分子结构  13-16
    2.1 编码 LT 的基因  13
    2.2 LT 蛋白的分子结构  13-16
  3 LT 的生物学特性  16
    3.1 LT 与细胞膜表面的结合--GM1 结合活性  16
    3.2 LT 与 ADP-核糖化因子（ARF）的结合  16
    3.3 LT 与 NAD 的结合  16
  4 LT 的佐剂功能  16-20
    4.1 LT 的毒性作用  16-17
    4.2 LT 的粘膜免疫原性和免疫调节作用  17-18
    4.3 LT 的粘膜免疫佐剂效应  18-19
    4.4 LT 突变体的研究  19-20
  5 LT 诱导细胞因子免疫应答  20-26
    5.1 T 细胞免疫调控作用  21-22
    5.2 CD4+T 细胞的免疫调节作用  22
    5.3 细胞因子  22-26
第一章 小鼠细胞因子实时定量 PCR 方法的建立  26-43
  1 实验材料  26-28
    1.1 主要仪器  26
    1.2 主要试剂及试剂盒  26-27
    1.3 菌株  27
    1.4 培养基及溶液配制  27-28
  2 实验方法  28-34
    2.1 小鼠脾脏总 RNA 提取  28
    2.2 总 RNA 的反转录反应  28-29
    2.3 引物设计  29
    2.4 目的片段的 PCR 扩增  29-30
    2.5 质粒标准品制备  30-32
    2.6 质粒纯度测定  32-33
    2.7 标准曲线的建立  33-34
  3 结果  34-42
    3.1 细胞因子基因片段重组质粒的鉴定  34-35
    3.2 细胞因子标准曲线的建立  35-42
  4 讨论  42-43
第二章 LT 诱导巨噬细胞中细胞因子动态变化的研究  43-64
  1 实验材料  43-44
    1.1 主要仪器  43
    1.2 主要试剂及试剂盒  43-44
    1.3 菌株和细胞  44
    1.4 主要试剂配制  44
  2 实验方法  44-48
    2.1 细胞复苏  44-45
    2.2 细胞传代  45
    2.3 Real-time PCR 检测不同剂量 LTRG 对小鼠巨噬细胞中细胞因子的刺激  45-46
    2.4 Real-time PCR 检测 LT 蛋白对小鼠巨噬细胞中细胞因子的刺激  46-47
    2.5 Real-time PCR 检测 LTRG 与 BSA 协同处理对小鼠巨噬细胞中细胞因子的影响  47
    2.6 液相芯片检测细胞上清液中细胞因子的变化  47-48
    2.7 数据统计  48
  3 结果  48-61
    3.1 不同剂量 LTRG 对小鼠巨噬细胞中细胞因子的影响  48-49
    3.2 LT 蛋白对小鼠巨噬细胞中细胞因子的影响  49-54
    3.3 LTRG 与 BSA 蛋白共同免疫对小鼠巨噬细胞中细胞因子的影响  54-58
    3.4 液相芯片技术分析 LT 对巨噬细胞中细胞因子的影响  58-61
  4 讨论  61-64
    4.1 不同剂量 LTRG 对巨噬细胞中细胞因子的影响  61
    4.2 LT 蛋白对巨噬细胞中细胞因子的影响  61-62
    4.3 LTRG 和 BSA 协同作用对巨噬细胞中细胞因子的影响  62
    4.4 液相芯片技术分析 LT 对巨噬细胞中细胞因子的影响  62-64
第三章 实时定量 PCR 检测 LT 诱导小鼠脾脏中细胞因子动态变化  64-73
  1 实验材料  64-65
    1.1 主要仪器  64
    1.2 主要试剂及试剂盒  64-65
    1.3 菌株和实验动物  65
    1.4 主要试剂配制  65
  2 实验方法  65-67
    2.1 动物试验  65
    2.2 小鼠脾脏总 RNA 提取  65-66
    2.3 RNA 浓度和纯度的测定  66
    2.4 总 RNA 的反转录反应  66-67
    2.5 所用引物和质粒  67
    2.6 Real-time PCR 反应  67
    2.7 数据统计  67
  3 结果  67-71
    3.1 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 IL-1β表达量变化  67
    3.2 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 IL-12 表达量变化  67-68
    3.3 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 IFN-γ表达量变化  68-69
    3.4 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 TNF-α表达量变化  69-70
    3.5 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 IL-4 表达量变化  70
    3.6 LT 蛋白免疫后小鼠脾脏中 IL-6 表达量变化  70-71
  4 讨论  71-73
第四章 LTRG 感染小鼠后脾脏组织中 T 淋巴细胞的动态变化  73-78
  1 实验材料  73-74
    1.1 主要仪器  73
    1.2 主要试剂  73
    1.3 菌株和实验动物  73
    1.4 主要试剂配制  73-74
  2 实验方法  74-75
    2.1 动物试验  74
    2.2 脾脏淋巴细胞悬液制备  74
    2.3 细胞计数  74
    2.4 细胞表面染色  74
    2.5 数据统计  74-75
  3 结果  75-76
    3.1 LT 免疫小鼠脾脏组织中 CD3+阳性 T 淋巴细胞的动态变化  75
    3.2 LT 免疫小鼠脾脏组织中 CD4+阳性 T 淋巴细胞的动态变化  75-76
    3.3 LT 免疫小鼠脾脏组织中 CD8+阳性 T 淋巴细胞的动态变化  76
  4 讨论  76-78
全文总结  78-79
参考文献  79-89
致谢  89

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 野生动物疾病 > 实验用动物
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