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低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白的筛选及鉴定

作　者: 许俐
导　师: 刘国顺
学　校: 河南农业大学
专　业: 烟草学
关键词: 烟草低氮胁迫蛋白质组质谱亲环素
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
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内容摘要

为了研究低氮营养条件下，烟草叶片蛋白质表达的差异，我们利用2-DE蛋白质双向电泳对正常营养下和低氮营养下成熟期（移栽后70d）烟草中部叶片进行了差异蛋白质组表达分析，并利用质谱技术对差异表达的蛋白进行了鉴定。与正常营养条件下的叶片相比，在低氮处理下，烟草叶片中共鉴定出5个差异蛋白。其中有4个为注释蛋白，分别是：亲环素蛋白（cyclophilin-like protein，CyP2）,液泡转化蛋白（vacuolar invertase INV2）, MAR结合蛋白（MAR-binding protein）以及MCM蛋白（MCM protein-like protein）。MCM蛋白在低氮处理中表达量较低，其他四种蛋白（包括一个未注释的假定蛋白putative protein）在低氮处理下表达量均较高。为了验证低氮条件下烟草叶片差异蛋白的表达情况，我们对5个差异蛋白在mRNA水平的表达做了研究，结果发现其mRNA水平的表达水平与蛋白质表达水平一致。在5个差异表达蛋白中鉴定出的亲环素蛋白（CyP2）是一个逆境胁迫反应蛋白，可能在烟草逆境胁迫中起到调节作用。因此，我们对低氮胁迫下烟草叶片在烟株移栽后的不同时期（50d,60d,70d）的CyP2基因在mRNA水平上的表达做了研究，经定量PCR实验分析，发现相对于正常营养条件下的叶片CyP2基因的转录量在低氮营养下叶片中表达较强，且随发育进程呈显著升高，结果说明低氮胁迫可诱导烟草叶片CyP2基因mRNA的大量表达，尤其在成熟的叶片中表达更强。水培实验条件下的控制实验也验证了低氮胁迫确实可以诱导CyP2基因mRNA的表达。亲环素是一个多基因家族，为了进一步了解亲环素家族基因在烟草生长发育过程中的功能，我们对烟草中三个亲环素家族的基因（CyP1，CyP2，CyP40）进行了表达模式研究。结果显示在不同发育时期中， CyP1在烟草的移栽后40d,50d以及60d时表达量较高，CyP2则是在移栽后30d，40d，60d表达量较高，而CyP40只在移栽后60d表达量较高。这说明三种亲环素基因在烟草叶片不同发育时期中都偏向于在叶片发育后期表达。在不同组织部位及器官的表达中，三个亲环素家族基因在中部叶和下部叶中表达均较强。在烟草根中主要表达CyP1和CyP40基因， CyP40还在花中表达较高，而CyP2基因的主要表达器官为叶片。本论文的研究结果表明，低氮营养低氮胁迫条件可以诱导叶片CyP2蛋白和基因的表达，且CyP2基因的主要表达器官也是在叶片中,尤其是日趋成熟的叶片，表明叶片是CyP2基因的主要调节靶器官。CyP2基因作为一个胁迫应激蛋白可能参与了烟草响应低氮胁迫下叶片生长生理调节过程，与烟草的抗逆生长有着密切的关系。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-8
1.文献综述  8-14
  1.1 氮素对烟草生长发育的影响  8-9
    1.1.1 氮素对烟草生长发育的影响  8
    1.1.2 施氮量对烟草的影响  8-9
  1.2 低氮对植物及烟草的影响  9-10
    1.2.1 低氮对植物产量及品质的影响  9-10
    1.2.2 低氮对烟草产量及品质的影响  10
  1.3. 蛋白质组学研究技术概况及在植物研究中的应用  10-14
    1.3.1 蛋白质组学研究技术概况  10-12
    1.3.2 蛋白质组研究在植物上的应用  12-14
2.引言  14-15
3.实验材料与方法  15-22
  3.1 实验材料  15
  3.2 实验仪器与设备  15
  3.3 试验设置  15-16
  3.4 蛋白质样品制备及鉴定分析  16-17
  3.5 总 RNA 的提取及检测分析  17
  3.6 RNA 反转录及第一链 cDNA 的合成  17
  3.7 实时荧光定量 PCR 及半定量 PCR  17-19
  3.8 CyP2 基因超表达与沉默表达载体的构建  19-22
4.结果与分析  22-36
  4.1 低氮对烟草生长过程中叶长，叶宽及株高的影响  22-23
  4.2 低氮条件下烟草叶片差异蛋白的鉴定  23-29
    4.2.1 低氮和正常营养条件下成熟期中部叶片蛋白的表达差异  23-24
    4.2.2 差异蛋白的质谱鉴定  24-29
  4.3 低氮条件下叶片差异蛋白 mRNA 的表达  29-30
  4.4 控制条件下低氮诱导烟草中部叶片亲环素基因（CyP2）的表达分析  30-31
  4.5 亲环素基因（CyP1 ，CyP2， CyP40）在烟草不同叶位叶片及不同器官中的表达模式研究  31-32
  4.6 亲环素基因（CyP2）沉默和超表达载体的构建  32-36
5.讨论  36-38
  5.1 低氮对烟株农艺性状的影响  36
  5.2 低氮条件下烟草叶片差异蛋白的鉴定  36-37
  5.3 低氮条件下烟草叶片中差异蛋白在 mRNA 水平的表达  37
  5.4 低氮条件下烟草叶片中 CyP2 基因在不同发育时期的 mRNA 表达  37-38
  5.5 烟草亲环素基因在烟草不同器官及中部叶片不同发育时期的表达规律  38
6.结论  38-39
参考文献  39-46
英文摘要  46-47

低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白的筛选及鉴定

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