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茶树SCPL生物信息及CsSCPL3功能的研究

作　者: 仇传慧
导　师: 夏涛
学　校: 安徽农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL) 基因家族分类功能分析
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

茶树中酯型儿茶素与非酯型儿茶素的区别仅在于C环3位上有无没食子基团。本课题组前期研究表明，催化非酯型儿茶素没食子酰基化的酶是一种酰基转移酶，且该酶可能属于丝氨酸羧肽酶类蛋白（SCPL）家族。为挖掘可能参与没食子酰基转移功能的基因，本文首先利用生物信息学手段，对茶树转录组及基因组数据库中的SCPL进行筛选、基序和进化树分析及功能预测。其次，利用RACE技术，克隆了茶树CsSCPL3基因全长，并利用荧光定量实时PCR、原核表达、酵母真核表达及农杆菌介导的烟草异源植物表达等技术，对该基因的组织特异性表达和功能进行预测。本论文研究旨在为茶树SCPL蛋白功能鉴定奠定基础。主要研究结果如下：1.参考拟南芥的分类方法，对来自茶树转录组及基因组测序数据库中49条CsSCPLs蛋白序列的基序和进化关系进行了分析和分类，结果表明，49条茶树CsSCPLs可分3类，其中9条和8条分别属于CladeIA和CladeIB类蛋白；17条和15条分别属于CladeⅡ和CladeⅢ类蛋白。与酰基转移相关的蛋白属于CladeIA类。2.采用RT-PCR技术，克隆了茶树CladeIA类中的CsSCPL3基因的全长序列。CsSCPL3的全长为1686bp，开放阅读框长度为1413bp，预测其分子量54.7KD，等电点5.81。3.对CsSCPL3蛋白进行了生物信息学分析，结果表明CsSCPL3具有SC族羧肽酶中S10家族特有的高度保守的“α/β水解酶折叠”结构；该蛋白包含了1个底物结合位点、3个催化作用保守区和多个N-糖基化位点、及其Ser-Asp-His三联体催化中心等SCPL家族的典型特征；预测CsSCPL3蛋白可能为分泌蛋白；该蛋白还可能存在4种修饰方式，即N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、以及N-端豆蔻酰化位点。4.实时荧光定量PCR结果显示，CsSCPL3在芽、叶、茎和根中都有表达，其中在叶中的相对表达量明显高于茎和根；在幼嫩的芽中表达量明显高于成熟叶。5．构建了pET32a-CsSCPL3重组质粒进行原核表达，并研究了不同诱导温度、不同诱导时间等条件对重组蛋白表达的影响。结果表明，CsSCPL3基因的最佳诱导条件为37℃诱导4h；目标蛋白条带的分子量为70KD，与预测大小相符，表达蛋白以包涵体形式存在。6.构建了pYES-dest52-CsSCPL3重组质粒进行真核表达，成功实现了CsSCPL3基因在酿酒酵母中的表达，但未检测到酶活性。7.构建了pCB2004-CsSCPL3重组质粒，利用农杆菌EHA105侵染烟草，获得了转基因烟草。转基因烟草中的CsSCPL3功能有待进一步验证。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-7
1.文献综述  7-15
  1.1 羧肽酶研究进展  7-9
  1.2 丝氨酸羧肽酶的研究进展  9-13
  1.3 茶树丝氨酸羧肽酶及其类蛋白家族  13-15
2 引言  15-17
  2.1 研究意义  15
  2.2 研究内容  15-16
  2.3 技术路线  16-17
3 材料与方法  17-24
  3.1 材料来源  17
  3.2 仪器与试剂  17-18
  3.3 方法  18-24
4 结果与分析  24-40
  4.1 CSSCPL 家族分类  24-28
  4.2 CSSCPL3 基因的克隆及生物信息学分析  28-34
  4.3 CSSCPL 荧光定量分析  34-36
  4.4 CSSCPL3 原核表达分析  36-37
  4.5 CSSCPL3 真核表达分析  37-38
  4.6 转化烟草  38-40
5.讨论  40-45
  5.1 CSSCPL 家族分析  40-41
  5.2 CSSCPL3 生物信息学分析  41-43
  5.3 CSSCPL3 表达部位  43
  5.4 CSSCPL3 融合蛋白表达难度  43-45
6 结论  45-46
参考文献  46-49
致谢  49
作者简介  49
成果清单  49

茶树SCPL生物信息及CsSCPL3功能的研究

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