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OsMND1调节PMeS（polyploid meiosis stability）水稻花粉发育的功能分析与验证

作　者: 甘露
导　师: 何玉池
学　校: 湖北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 减数分裂功能分析 OsMND1 RNAi 超量表达
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 21次
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内容摘要

多倍体化一直被认为是推动植物进化和新品种形成的重要因素,主要作物小麦、棉花、油菜伴随着基因组的加倍带来了产量的大幅上升。水稻被认为是古多倍体,多倍体水稻从进化角度来看具有产量和抗逆性的双重优势。但是多数多倍体水稻因基因剂量的加倍导致减数分裂紊乱,花粉育性和结实率大幅降低。因此多倍体育种要取得突破,提高结实率是关键,长期困扰多倍体水稻育种的低结实问题期待着关键种质的发掘。本实验室在利用远缘杂交和多倍体化双重优势选育超级稻的战略的指导下,选育出2个具有减数分裂稳定性PMeS (polyploid meiosis stable,PMeS)特征的多倍体水稻品系,PMeS水稻品系HN2026-4X因其减数分裂稳定且具有高结实的特点被认为是类Ph材料,其减数分裂行为、花粉育性及结实率与二倍体极其相似。其他多倍体与之杂交能获得了结实率较高的杂交组合,突破了长期困扰多倍体育种的低结实瓶颈,并证实PMeS的高结实特点可以稳定遗传。但关于关键种质PMeS花粉育性的机制有待深入系统的研究。OsMND1基因是酵母(S. cerevisiae)减数分裂相关的MND1 (meiotic nuclear divisions 1)基因在水稻中的同源基因。有报导拟南芥中有含有同源性很高的基因MND1,在减数分裂过程中对同源染色体的配对、联会和重组起着非常重要的作用,而在水稻中未见报导。前期实验已经完成了减数分裂相关基因OsMND1的克隆,水稻中超量表达载体与干扰表达载体的构建,以及该基因在原核生物和真核生物中表达载体的构建。本研究主要完成以下实验内容：1)对载体进行验证,对前期实验构建的载体分别进行PCR和酶切验证,验证结果正确。2)为了深入探索OsMND1的功能,本研究分别从基因超量表达和基因沉默两条途径进行转基因研究,试图从正向和反向来证明该基因的功能。我们利用构建好的OsMND1基因超量表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品系BLL-2X的愈伤组织,优化水稻转基因体系,得到了抗性植株。对其进行初步PCR筛选后,又利用实时荧光定量PCR技术检测证明阳性植株中目的基因表达量有一定的上调,我们分别对T0、T1代进行农艺性状初步分析,以研究其超量表达之后对水稻产生的影响,结果显示花粉育性与结实率并没有的发生明显的变化,分析可能是由于选用的BLL-2X本身就是高结实的材料,其减数分裂正常,因此该基因的超量表达不会带来花粉育性的大幅改变。我们需要在后续工作中进一步将转基因的BLL-2X加倍成四倍体后再分析其农艺性状。实验中发现转化植株的分蘖数增加异常显著,具体原因有待进一步深入研究。3)同时,通过农杆菌介导RNAi载体转化水稻品系PMeS HN2026-4X(高结实品系),得到抗性植株。我们对其进行PCR检测筛选后,初步证明已获得了转基因植株,对其T0代转基因植株农艺性状进行了分析,其结实率和花粉育性显著降低,与对照植株相比,平均结实率下降92.53%,花粉育性下降81.91%,其他性状未见明显改变。结果表明干扰OsMND,基因的表达显著降低水稻花粉的育性,推测该基因可能参与调节多倍体水稻的减数分裂,乒体的调节机制需要更深入的实验来验证。4)本实验通过优化OsMNDl在大肠杆菌中的表达条件和目的蛋白的纯化条件,成功制备了纯度较高的目的蛋白,为后期通过免疫实验探讨该基因在花粉发育期间的时空表达打下了很好的基础。但这部分内容由于时间的关系未完全完成。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
主要符号表  12-13
第一部分综述  13-26
  1.1 植物基因工程的研究进展  13-15
    1.1.1 基因工程的研究现状  13
    1.1.2 水稻基因工程的进展  13-15
  1.2 植物基因工程的研究内容  15-18
    1.2.1 目的基因的获取  15-16
    1.2.2 外源基因的功能验证及表达载体构建  16
    1.2.3 外源基因导入目标植物中——转化  16
    1.2.4 转基因植物的筛选、鉴定  16-18
  1.3 水稻遗传转化的方法介绍  18-19
  1.4 转基因植物中外源基因的整合  19-21
    1.4.1 外源基因的整合分析方法  19-20
    1.4.2 外源DNA整合的遗传效应  20-21
  1.5 减数分裂分子机理的研究  21-24
    1.5.1 减数分裂分子生物学事件  21-22
    1.5.2 PMeS品系减数分裂相关机制的研究进展与意义  22-23
    1.5.3 减数分裂相关基因的研究  23-24
    1.5.4 水稻作为减数分裂研究模式生物的优越性  24
  1.6 关于MND1基因的研究  24-26
第二部分材料与方法  26-43
  2.1 材料与仪器  26-32
    2.1.1 水稻材料  26
    2.1.2 菌种与质粒  26-27
    2.1.3 培养基  27-28
    2.1.4 酶与试剂  28-29
    2.1.5 主要仪器和设备  29
    2.1.6 主要溶液与试剂配方  29-32
  2.2 实验方法  32-43
    2.2.1 细菌的培养方法  32
    2.2.2 重组载体的遗传稳定性检测与菌种保存  32
    2.2.3 质粒DNA的抽提及纯化  32-33
    2.2.4 大肠杆菌感受态的制备  33
    2.2.5 大肠杆菌的转化  33
    2.2.6 重组子的PCR检测和酶切鉴定  33-34
    2.2.7 水稻愈伤组织的诱导与继代  34
    2.2.8 农杆菌转化愈伤组织  34-35
    2.2.9 CTAB法大量抽提水稻基因组DNA  35-36
    2.2.10 SDS法快速抽提水稻基因组DNA  36
    2.2.11 阳性植株的PCR鉴定  36
    2.2.12 水稻RNA的提取  36-37
    2.2.13 RNA完整性的检测  37
    2.2.14 cDNA的获得  37-39
    2.2.15 T1代植株的实时荧光定量PCR分析  39
    2.2.16 基因在大肠杆菌中的诱导表达  39-40
    2.2.17 SDS-PAGE电泳及染色  40-41
    2.2.18 确定带组氨酸标签的目的蛋白的可溶性  41
    2.2.19 高纯度包涵体的制备  41
    2.2.20 蛋白的纯化过程  41-43
第三部分结果与分析  43-58
  3.1 OSMND1基因转化水稻用超量表达载体和干扰载体的检测验证  43-45
    3.1.1 干扰表达载体的验证  43-44
    3.1.2 超量表达载体的验证  44-45
  3.2 农杆菌介导的RNAI载体转化水稻及其验证分析  45-49
    3.2.1 OsMND1基因为靶标的RNAi载体转化水稻HN2026-4X  45-47
    3.2.2 TO代抗性植株的分子学检测  47-48
    3.2.3 抗性植株农艺性状的分析  48-49
  3.3 农杆菌介导的超量表达载体转化水稻及其检测分析  49-55
    3.3.1 OsMND1基因为靶标的超量表达载体转化水稻BLL-2X  49-50
    3.3.2 TO代抗性植株的PCR检测  50-51
    3.3.3 实时荧光定量PCR检测目的基因在阳性植株中的表达情况  51-53
    3.3.4 抗性植株农艺性状的分析  53-55
  3.4 OsMND1基因在原核生物中表达及后期的研究方向  55-58
    3.4.1 OsMND1基因在大肠杆菌中的诱导表达条件的优化  55
    3.4.2 OsMND1基因在大肠杆菌中表达蛋白的纯化  55-57
    3.4.3 对纯化的目的蛋白进行后期的实验设计  57-58
第四部分讨论  58-61
  4.1 关于OSMND1基因功能的研究  58-59
  4.2 下一步工作设想  59-61
图版及其说明  61-64
参考文献  64-69
致谢  69

OsMND1调节PMeS（polyploid meiosis stability）水稻花粉发育的功能分析与验证

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