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东方山羊豆4香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）基因的克隆与表达研究

作　者: 杨冬梅
导　师: 高洪文
学　校: 中国农业科学院
专　业: 草业科学
关键词: 东方山羊豆 4香豆酸 辅酶A连接酶 RACE 荧光定量PCR 正义表达载体 反义表达载体
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


东方山羊豆(Galega orientalis L.)是20世纪末引种到我国的牧草品种,为发掘其基因资源,本实验克隆出东方山羊豆4CL基因,探索其在东方山羊豆体内的表达,研究4CL基因对东方山羊豆抗逆性的影响,为今后东方山羊豆在我国的种植和应用奠定基础。本研究取得以下成果:1、获得目的基因的全长序列采用RACE技术结合RT-PCR方法从东方山羊豆中获得编码4CL基因的cDNA全长序列,命名为Go4CL。该序列全长1916bp,开放阅读框1653bp,编码510个氨基酸。序列分析表明:Go4CL基因编码的蛋白含4CL类蛋白特异的AMP-binding保守结构域LPYSSGTTGLPK和催化活化中心GEICIRG。同时该基因编码的蛋白与其他同源蛋白序列有较高相似性。2、Go4CL基因的表达特性利用Real-Time PCR方法检测发现,Go4CL基因在东方山羊豆的根中表达量最高,叶中表达量最少。在PEG、ABA、MeJA、SA胁迫处理下Go4CL基因的表达量均有不同程度的上调,说明此基因在植物抵御干旱、病菌侵袭和机械损伤等胁迫过程中能够起到调控作用。3、表达载体的构建及转基因研究成功构建了东方山羊豆Go4CL基因的正义表达载体和反义表达载体,为今后调控Go4CL基因在植物体内的表达量,培育出抗性强、木质素含量适中的更为优质的东方山羊豆材料奠定基础。通过农杆菌侵染法将Go4CL基因正义表达载体转化烟草,获得了T0代转基因植株,通过PCR对转基因烟草进行检测,获得了4CL增强表达转基因T0代株系。在17株T0代阳性小苗中,有13株小苗PCR检测为阳性,转化率约为77%。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 文献综述  10-15
  1.1 木质素的生物功能  10
  1.2 木质素对人类生产的影响  10
  1.3 木质素的结构及生物合成过程  10-11
  1.4 木质素生物合成过程中酶编码基因的表达调节  11-12
  1.5 4-香豆酸﹕辅酶A 连接酶对木质素合成途径的调节作用及研究进展  12-13
  1.6 基因工程技术对木质素合成途径遗传调控的研究进展  13-14
  1.7 东方山羊豆简介  14
  1.8 本研究的目的及意义  14-15
第二章 东方山羊豆4CL 基因的克隆及特性分析  15-33
  2.1 材料与方法  15-25
    2.1.1 试验材料  15-16
    2.1.2 试验方法  16-25
  2.2 结果与分析  25-32
    2.2.1 东方山羊豆总RNA 的提取  25-26
    2.2.2 G04CL 基因保守结构域的克隆  26
    2.2.3 东方山羊豆4CL 基因3’端和5’端cDNA 的克隆  26-27
    2.2.4 东方山羊豆4CL 基因全长的克隆  27
    2.2.5 G04CL 基因的生物信息学分析  27-28
    2.2.6 东方山羊豆与其他物种4CL 蛋白的系统进化树分析  28
    2.2.7 G04CL 基因的基因组DNA 结构的分析  28-32
  2.3 讨论  32-33
第三章 东方山羊豆4CL 基因的荧光定量表达分析  33-41
  3.1 材料与方法  33-35
    3.1.1 试验材料  33
    3.1.2 实验方法  33-35
  3.2 结果与分析  35-39
    3.2.1 RT-PCR 检测引物质量  35-36
    3.2.2 Real-Time PCR 的扩增曲线和溶解曲线的分析  36
    3.2.3 相对定量的数据处理  36-37
    3.2.4 G04CL 基因的组织特异性表达  37-38
    3.2.5 G04CL 基因逆境胁迫下的表达模式  38-39
  3.3 讨论  39-41
第四章 东方山羊豆G04CL 基因超表达载体和反义表达载体的构建  41-48
  4.1 材料和方法  41-46
    4.1.1 材料  41
    4.1.2 方法  41-46
  4.2 结果与分析  46
    4.2.1 东方山羊豆G04CL 基因超表达载体P81121-G04CL 的构建  46
    4.2.2 东方山羊豆G04CL 基因反义表达载体的构建  46
  4.3 讨论  46-48
第五章 农杆菌介导的东方山羊豆G04CL 基因转化烟草及初步检测  48-54
  5.1 材料和方法  48-50
    5.1.1 材料  48
    5.1.2 方法  48-50
  5.2 结果与分析  50-53
    5.2.1 含表达载体P81121-G04CL 的农杆菌转化和检测  50-51
    5.2.2 转基因烟草的获得  51
    5.2.3 转基因烟草的PCR 检测  51-53
  5.3 讨论  53-54
第六章 结论  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
作者简历  60

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 饲料作物、牧草 > 多年生豆科牧草 > 其他
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