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黄瓜液泡膜H~+-PPase基因的cDNA克隆与表达分析

作　者: 洪艳艳
导　师: 史庆华
学　校: 山东农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜 H~+-PPase基因表达正义表达载体反义表达载体
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

液泡膜H~+-PPase是植物中普遍存在的一种质子泵,在盐胁迫、干旱胁迫以及低温胁迫下,它对维持植物细胞的离子平衡具有重要的作用;另外还可以作为调节因子控制植物生长素等物质的运输,在调节植物生长发育中具有一定的作用。黄瓜是我国最重要的蔬菜作物之一,在生产过程中经常遇到盐害、低温、干旱等逆境胁迫,而液泡膜H~+-PPase与植物对多种逆境的抗性具有密切的关系。随着黄瓜栽培面积尤其是设施栽培面积的不断扩大,盐害、低温胁迫等成为限制黄瓜生产的重要障碍因子。从不同的角度研究与黄瓜逆境有关的科学问题具有重要的意义。本试验以‘新泰密刺’黄瓜为试材,用RT-PCR结合RACE法从黄瓜幼叶中克隆了液泡膜H+-PPase基因的全长序列,构建了正反义表达载体,并利用RT-PCR的方法对非生物胁迫下黄瓜液泡膜H~+-PPase基因的表达进行了研究。主要结果如下:1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法,在黄瓜叶片中分离到黄瓜液泡膜H~+-PPase基因的中间片段,再结合RACE技术获得了黄瓜液泡膜H~+-PPase基因,命名为CuPPase。GeneBank注册号为GQ223786。2序列分析表明,CuPPase cDNA全长2,650 bp,编码区2307 bp,编码768个氨基酸,预测蛋白质分子量约为80 KD,理论pI值为5.32。该基因有14个强的跨膜螺旋结构,PlantCare分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温、干旱等诱导的顺式作用元件。3. CuPPase在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高低温胁迫诱导,并且与处理时间有密切关系,在三种胁迫条件下,其表达均表现先升高后降低的趋势。4.为研究黄瓜H+-PPase基因的功能,构建其正义表达载体pBI121-CuPPase和反义表达载体pBI121-CuPPase1。

全文目录

中文摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
引言  12-21
  1.1 液泡膜质子泵的结构及功能  12-17
    1.1.1 液泡膜质子泵的结构及活性调节  12-16
      1.1.1.1 液泡膜H~+_-ATPase  12-14
      1.1.1.2 液泡膜H~+_-PPase  14-15
      1.1.1.3 液泡膜H~+_-ATPase 和H~+_-PPase 的关系  15-16
    1.1.2 液泡膜质子泵的功能  16-17
      1.1.2.1 维持稳定的胞质和液泡液pH 值  16
      1.1.2.2 参与控制液泡膨压，维持细胞的体积  16
      1.1.2.3 促进多种离子和代谢产物的在液泡中的积累  16-17
      1.1.2.4 与植物激素相互作用，影响植物的生长发育  17
  1.2 液泡膜H~+_-PPase 对逆境的反应  17-19
    1.2.1 盐胁迫  17-18
    1.2.2 冷胁迫  18
    1.2.3 缺氧胁迫  18-19
  1.3 液泡膜H~+_-PPase 与生长素极性运输  19-20
  1.4 液泡膜H~+_-PPase 基因的克隆  20-21
2 材料与方法  21-33
  2.1 试验材料  21-22
    2.1.1 植物材料及处理  21
    2.1.2 菌株与质粒  21
    2.1.3 酶及生化试剂  21
    2.1.4 PCR 引物  21-22
  2.2 试验方法  22-33
    2.2.1 植物材料总RNA 的提取  22-24
    2.2.2 RNA 电泳检测  24
    2.2.3 反转录cDNA 第一条链的合成  24
    2.2.4 cDNA 纯化(用于5′RACE)  24-25
    2.2.5 cDNA 末端加尾(用于5′RACE)  25-26
    2.2.6 黄瓜H~+_-PPase 基因的cDNA 全长序列的获得  26-29
      2.2.6.1 中间片段一的克隆  26-27
      2.2.6.2 基因中间片段二的克隆  27
      2.2.6.3 3′RACE 获得3′端序列  27
      2.2.6.4 5′RACE 获得5′端序列  27-28
      2.2.6.5 基因全长的获得  28
      2.2.6.6 琼脂糖凝胶中DNA 片段的回收  28-29
    2.2.7 DNA 片段与克隆载体的连接  29
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备  29-30
    2.2.9 大肠杆菌的转化及筛选  30
    2.2.10 碱法质粒DNA 的提取  30-31
    2.2.11 质粒DNA 的酶切鉴定  31
    2.2.12 DNA 序列测定  31
    2.2.13 黄瓜H~+_-PPase 基因反义表达载体的构建  31-32
    2.2.14 黄瓜H~+_-PPase 基因正义表达载体的构建  32
    2.2.15 农杆菌感受态细胞的制备与转化  32-33
      2.2.15.1 农杆菌感受态细胞制备  32
      2.2.15.2 冻融法转化农杆菌  32-33
    2.2.16 黄瓜H~+_-PPase 序列的生物信息学分析  33
3 结果与分析  33-48
  3.1 黄瓜H~+_-PPase 基因的分离  33-37
    3.1.1 RNA 的提取及反转录  33-34
    3.1.2 中间片段一和片段二的分离  34-35
    3.1.3 3′片段的分离  35-36
    3.1.4 5′片段的分离  36
    3.1.5 全长cDNA 的分离  36-37
  3.2 黄瓜H~+_-PPase 基因的序列分析  37-42
    3.2.1 黄瓜H~+_-PPase 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列  37
    3.2.2 黄瓜H~+_-PPase 基因氨基酸序列分析  37-41
    3.2.3 液泡膜焦磷酸酶系统进化树分析  41-42
    3.2.4 跨膜结构分析  42
    3.2.5 顺式作用元件分析  42
  3.3 黄瓜液泡膜H~+_-PPase 基因的组织表达分析  42-44
    3.3.1 在不同器官中表达  42-43
    3.3.2 NaCl 处理对黄瓜叶片CuPPase 表达的影响  43
    3.3.3 高低温处理对黄瓜叶片 CuPPase 表达的影响  43-44
  3.4 黄瓜H~+_-PPase 基因正反义表达载体的构建  44-48
    3.4.1 黄瓜H~+_-PPase 基因反义表达载体的构建  44
    3.4.2 黄瓜H~+_-PPase 基因正义表达载体的构建  44-48
4 讨论  48-49
  4.1 基因全长的获得  48
  4.2 顺式作用元件分析  48
  4.3 不同胁迫处理下黄瓜H~+_-PPase 基因的表达  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-60
致谢  60-61
攻读硕士期间发表的论文情况  61

黄瓜液泡膜H~+-PPase基因的cDNA克隆与表达分析

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