学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

家蚕Ir和Foxo基因克隆鉴定及限食模型胰岛素信号通路基因的表达特征

作　者: 孔祥宾
导　师: 徐世清；司马杨虎
学　校: 苏州大学
专　业: 发育生物学
关键词: 胰岛素信号转导 限食 抗衰老 家蚕 基因克隆
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 91次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖等的诱发而分泌的蛋白质激素,通过细胞的信号转导发挥调节糖、脂肪和蛋白质代谢,影响生殖以及衰老等生长发育过程的作用。胰岛素信号传导途径是一条进化保守的信号传导途径,多种物种的衰老机制都涉及到胰岛素信号转导通路,利用低等生物来研究复杂的寿命现象成为可能。本文通过家蚕全基因组数据库资源进行挖掘分析,利用RT-PCR、RACE、RNA干涉等技术对Ir及Foxo基因进行了全基因克隆分析、表达模式分析以及初步的功能鉴定工作,同时还对限食与饥饿对家蚕不同组织的胰岛素/胰岛素样生长因子信号系统同源基因Akt、Ir、Foxo-s、Pdk、Irs、Ir-lp、Sirt2、Foxo、Pi3k60和Pi3k110表达影响进行了研究工作,形成结果如下。1 Ir与Foxo基因的家蚕序列数据库信息挖掘分别以黑腹果蝇和埃及伊蚊等物种的IR与FOXO同源蛋白质序列为质询序列,同源比对NCBI、SILKDB等生物数据库中家蚕全基因组数据库和EST数据库,发现在家蚕基因组中存在6条潜在的转录编码FOXO保守结构域序列,3个Ir同源基因,其中1个为已经克隆的家蚕Ir基因,另一个为未被克隆的表皮生长因子基因,还有1个为缺失Ir膜内激酶区的同源蛋白(命名为IR-LP)。Tblastn发现,家蚕基因组中有5条潜在的转录编码表皮生长因子蛋白序列片段,有2条潜在的编码未知IR同源蛋白序列片段。2家蚕Ir-lp、Foxo与Rtpk基因的cDNA克隆及分析根据基因挖掘线索,实验克隆了基因Ir-lp和Foxo,以及只有激酶区的一段相似最高的潜在编码序列(命名为Rtpk)。家蚕Foxo基因最大ORF框为1 641 bp,编码546氨基酸,分子量为59574.45 D,具有较长的5′UTR和较短的3′UTR,在92 to 181氨基酸位置具有FOXO蛋白的Forkhead (FH)典型结构域,属于转录调控因子家族。同源比对分析表明,该基因编码蛋白与人的FOXO3和FOXO1、果蝇的FOXOA和FOXOE、以及线虫的daf-16同源性较高,与果蝇的同源关系最近,与人与线虫的相差较大。克隆的家蚕胰岛素受体类似蛋白基因Ir-lp,其最长ORF框为1 812 bp,编码604个氨基酸残基,具有受体L臂和纤维连接蛋白3的结构域,3’RACE的结果证实,其没有像胰岛素受体类似激酶结构域,与基因挖掘预测结果一致,前400个氨基酸残基与人类和果蝇的同源蛋白高度保守,进一步说明克隆的基因为IR家族家蚕同源基因。在家蚕基因组IR蛋白质同源编码序列挖掘过程中,发现了1个与Ir基因激酶区序列同源性最高的只包括激酶区约400个氨基酸残基的序列。cDNA片段克隆分析结果显示,其编码的蛋白质属于蛋白酪氨酸激酶家族,为受体型酪氨酸蛋白激酶,其激酶序列与人类、果蝇和线虫高度保守。3 Ir与Foxo基因的表达模式5龄第3日幼虫期Ir基因的表达量在8个调查的组织间差异不大,血淋巴中相对较低;而Ir-lp基因的表达量在组织间差异显著,头部组织含量最高,其次为血淋巴和马氏管,最低为脂肪体。胰岛素受体的类似物基因Ir-lp在催青3d的胚胎中有较高的表达量,而4d的胚胎中下降。1-3龄起蚕Ir-lp基因有高峰值表达,5龄起蚕脂肪体中表达量下降,5龄第7d和熟蚕期出现波动,蛹期开始逐渐上升,蛹和成虫无论雌雄均有较高表达量。推测蛹和成虫期的Ir-lp表达上调可能与提高幼虫期储存的能量利用效率有关,其它时期的上调机理无法判断。Foxo基因在血淋巴中有高于其它组织1倍的表达量,Foxo-s序列在各组织均有一定水平表达,其中脂肪体有高于中肠1倍的表达量。在催青3-4d胚胎、以及1-4龄起蚕中,Foxo-s基因几乎不表达,5龄前期幼虫的脂肪体中,该基因有较高水平表达,但随着生长有下降的趋势,并在化蛹前1 d升高,并在蛹和成虫期维持较高的表达量。Foxo基因在大部调查的家蚕时期的表达量均较低,只有1龄、蛹期和蛾期的少数时期有较高量表达。Rtpk基因在调查的发育时期中有显著的变化,催青3d胚胎中表达量较高,然后表达下调,从2龄幼虫(全蚕)一直到5龄7d的脂肪体中,全部都维持在较低的表达量,熟蚕期有突然的表达量上调,然后预蛹期降低,蛹期、蛾期的表达量相对较高,并且雌雄存在一定的差异。4 Ir与Foxo基因的RNA干涉下调表达合成了5个dsRNA干扰物,筛选确定了其中Ir600和Foxo520两个具有明显的干涉效果的片段,其有效浓度分别为1-20 nmol/L与1-10 nmol/L,有效干扰时间为处理后2-5d。在无血清的培养基中,家蚕BmN细胞逐渐凋亡坏死。5 nmol/L Foxo520干涉处理后5 d,凋亡细胞少于阴性对照,活细胞也较多;提示Foxo基因可能对血清缺乏诱导的细胞凋亡具有促进作用。Grace培养基培养的家蚕BmN细胞,在5 nmol/L Ir600 ds RNA处理3-6d,5 d时凋亡细胞数较对照组有显著增加。提示Ir基因的下调可能致使细胞凋亡。5限食与饥饿对家蚕不同组织胰岛素信号系统同源基因表达的影响成功复制了家蚕限食模型,利用该模型调查了长期限食与短时饥饿对家蚕5龄幼虫不同组织中10个胰岛素信号系统同源基因表达的影响。结果显示,长期限食后的进食状态家蚕,大于一半的基因在性腺、中肠、体壁中呈上调,马氏管、头部和血液中呈下调;饥饿刺激对自由进食的家蚕的影响,除了Foxo-s与Irs基因在性腺组织中上调外,更多基因则在马氏管与头部表现下调;饥饿刺激对长期限食家蚕的影响,表现为所有基因在马氏管和头呈上调趋势,在性腺中更多是下调趋势;长期限食对饥饿状态的家蚕影响,表现为更多基因在多数组织中表达上调,其中在马氏管与中肠最为明显,而生殖腺的情况则相反。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-15
第一章 胰岛素信号系统与衰老的关系及其在家蚕中的研究进展  15-31
  1 胰岛素信号系统简介  15-23
    1.1 胰岛素  16
    1.2 胰岛素样生长因子和胰岛素样多肽  16-17
    1.3 胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体  17-19
    1.4 胰岛素受体底物（IRS）  19-20
    1.5 三磷酸肌醇激酶（PI3K）  20
    1.6 叉状头转录因子O 家族（FOXO）  20-21
    1.7 限食抗衰老与胰岛素信号系统间的关系  21-23
  2 家蚕胰岛素类肽及其信号系统  23-31
    2.1 家蚕胰岛素类肽的发现  23-24
    2.2 家蚕胰岛素的结构  24-25
    2.3 家蚕素的分泌模式  25-26
    2.4 家蚕胰岛素的基因多拷贝  26-27
    2.5 家蚕胰岛素表达特点  27
    2.6 家蚕胰岛素功能  27-29
    2.7 胰岛素类多肽的下游信号系统  29-30
    2.8 家蚕是胰岛素信号系统研究的良好材料  30-31
第二章 Ir 与 Foxo 基因的家蚕序列数据库信息挖掘  31-41
  1 材料与方法  31-32
    1.1 数据来源  31-32
    1.2 软件  32
    1.3 方法  32
  2 结果与分析  32-39
    2.1 家蚕Ir 基因的数据挖掘  32-37
    2.2 Foxo 基因的数据挖掘  37-39
  3 讨论分析  39-41
第三章 家蚕 Ir-lp 与 Foxo 基因的 cDNA 克隆及分析  41-58
  1 材料与方法  41-49
    1.1 实验动物  41
    1.2 主要数据库及网址  41
    1.3 主要生物信息学软件  41-42
    1.4 主要试剂  42
    1.5 主要溶液及配制  42-44
    1.6 引物设计  44-46
    1.7 总RNA 的提取  46-47
    1.8 逆转录合成cDNA  47
    1.9 聚合酶链式反应  47
    1.10 利用 5'-Full RACE Core Set Kit 扩增 5'cDNA 末端  47-48
    1.11 PCR 产物的回收  48
    1.12 连接反应  48
    1.13 感受态细胞的制备  48
    1.14 重组质粒的转化  48-49
    1.15 重组质粒的筛选  49
    1.16 质粒DNA 的制备  49
  2 结果与分析  49-56
    2.1 家蚕 Foxo 基因全长 cDNA 的克隆  49-50
    2.2 家蚕 Ir-lp 基因 cDNA 序列的克隆  50-55
    2.3 家蚕Rtpk 基因部分序列克隆与分析  55-56
  3 讨论与分析  56-58
第四章 Ir 与 Foxo 基因的表达模式与功能初探  58-82
  1 材料与方法  58-72
    1.1 材料  58-64
    1.2 方法  64-72
  2 实验结果  72-80
    2.1 基因表达谱分析  72-76
    2.2 RNA 干涉Ir 基因与Foxo 基因  76-80
  3 分析与讨论  80-82
第五章 家蚕限食动物模型的复制  82-89
  1 材料与方法  82-83
    1.1 实验动物  82-83
    1.2 饲养条件  83
    1.3 饲料  83
    1.4 实验分组  83
    1.5 食下量统计方法  83
    1.6 龄期统计  83
  2 实验结果  83-87
    2.1 家蚕幼虫不同龄期的日均食下量  84-85
    2.2 限食延长了幼虫的存活时间  85-87
    2.3 限食减轻了家蚕体重  87
  3 讨论分析  87-89
第六章 胰岛素信号系统同源基因在限食模型不同组织中表达模式分析  89-115
  1 材料与方法  89-90
    1.1 材料  89
    1.2 引物设计  89
    1.3 PCR 反应  89-90
  2 结果  90-110
    2.1 PCR 循环数对不同基因扩增效率的影响  90-91
    2.2 限食与饥饿对 Akt 基因表达的影响  91-93
    2.3 限食对Ir 基因的表达的影响  93-95
    2.4 限食对Foxo 基因表达的影响  95-97
    2.5 限食对Foxo-s 基因的表达的影响  97-99
    2.6 限食对pdk 基因的表达的影响  99-101
    2.7 限食对Irs 基因的表达的影响  101-103
    2.8 限食对Ir-lp 基因的表达的影响  103-105
    2.9 限食对Sirt2 基因的表达的影响  105-107
    2.10 限食对Pi3k110 基因的表达的影响  107-109
    2.11 限食对Pi3k60 基因的表达的影响  109-110
  3 分析讨论  110-115
第七章 综合结论与讨论  115-119
  1 Ir-lp、Foxo 与Rtpk 基因推导的编码蛋白具有其典型结构域  115-116
  2 Ir-lp 与Foxo 基因的表达模式与发育进程相关  116-117
  3 Ir 与Foxo 基因的参与细胞凋亡调控  117
  4 限食与饥饿家蚕胰岛素信号系统同源基因表达变化  117-119
参考文献  119-130
研究生期间发表的文章  130-131
研究生期间参加的课题  131-132
附录  132-138
致谢  138-140

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 天然来源的抗衰老先导化合物的化学结构及作用机理研究,R285.5
  3. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  4. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  5. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  6. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  7. 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511
  8. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  9. 烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析,Q943.2
  10. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  11. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  12. 红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析,TQ927
  13. 产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析,TQ925
  14. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  15. 荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析,S432.4
  16. 烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析,S433.4
  17. 新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建,S512.1
  18. 短柄草磷转运蛋白基因的克隆与功能分析,S543.9
  19. 野生种马铃薯蛋白酶抑制剂基因CYS和API的克隆及SpCYS转化马铃薯和烟草的初步研究,S532
  20. 地被菊匍匐茎横向重力性相关基因的发掘,S682.11
  21. 萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析,S631.1

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com