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鸭大肠杆菌acrB基因的缺失突变株构建及其相关功能研究

作　者: 孟春萍
导　师: 胡功政
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鸭源大肠杆菌 Red重组系统 acrB基因缺失主动外排系统荧光定量PCR
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

采用λ噬菌体Red重组系统构建鸭大肠杆菌标准菌株073的acrB基因缺失突变株,采用荧光定量RT-PCR方法,测定并比较了O73及其不同药物诱导的5株耐药菌、acrB基因缺火突变菌株及其不同药物诱导的5株acrB基因缺失菌的主动外排基因和调控基因的mRNA的表达水平,探讨多重耐药性产生和调控的分子机制。本试验创新建立适合动物源细菌耐药基因敲除、构建耐药基因缺失株的分子生物学方法,为进一步开展多耐药基因同时缺失奠定方法学基础。利用λ噬菌体Red重组系统对鸭大肠杆菌标准菌株O73的acrB基因进行敲除。首先,基于禽大肠杆菌acrB基因的已知序列,PCR扩增获得两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段。然后,将pkD46质粒转化入O73,再把含有卡那霉素抗性基因的打靶DNA片段电转化入O73/pkD46。在Red重组系统表达重组酶的帮助下,卡那霉素抗性基因两侧的acrB基因同源序列与鸭大肠杆菌染色体上的acrB基因发生同源重组,用卡那霉素抗性平板筛选得到阳性克隆。结果表明：用短同源臂和长同源臂的Red重组技术,均得到了acrB基因敲除菌株O73ΔacrB。长同源臂的电转化效率高于长同源臂,但其打靶DNA片段的构建较为困难。采用微量稀释法测定AcrB基因敲除前、后及用5种不同药物(庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素)诱导后相应O73菌株的耐药表刑。结果表明：敲除acrB基因后的073菌株,其药物敏感性明显较原标准菌株升高。庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素的MIC,敲除前分别为：2、8、16、2和8μg/mL敲除后的分别为：1、0.06、2、0.03和05μg/mL。O73经5种药物分别诱导30代后,测得的MIC值均达到128μg/mL;而073AacrB经5种药物分别诱导30代后,测得的MIC值分别为：4、2、4、2和4μg/mL,且继续诱导,其MIC值也不能再升高。这表明：acrB基因在主动外排中的有重要作用。用荧光定量RT-PCR方法,测定了上述12株菌的5种主动外排基因acrA、acrD、tolC acrE、acrF基因和3种主动外排调控基因mar A、soxS、rob A基因的mRNA表达水平,反向研究acrB基因在鸭大肠杆菌多重耐药中的作用。对于O73的5种诱导菌株,acrA和tolC的表达量均有上升,恩诺沙星诱导尤为明显；acrF的表达量在各种药物诱导株中都有所下降；恩诺沙星诱导时,marA基因的表达量增加更为明显；5种药物诱导的菌株,soxS基因的表达量均有所下降。庆大霉素诱导时,acrD和acrE基因的mRNA表达量增加明显；多西环素诱导时,robA基因mRNA表达量增加明显。对于O73ΔacrB,acrA的表达量显著代偿性增长,三种止向调控基因的表达量也显著增加,marA的表达量增加尤为突出。这表明：在敲除acrB基因后,其主动外排调控基因相应的作用增强。O73ΔacrB其经过药物诱导后,3种外排调控基因的表达量都有所增加,而且增加幅度远远高于073的药物诱导菌株。氟苯尼考、恩诺沙星诱导的,acrD的表达量增加明显；庆大霉素诱导时,其acrE基因mRNA表达量增加较为明显。

全文目录

致谢  5-9
摘要  9-11
文献综述  11-27
  1.1 主动外排耐药机制  11-12
  1.2 主动外排机制及其调控因子  12-20
    1.2.1 主动外排机制的特点  12-14
    1.2.2 AcrAB-TolC系统的结构及功能  14-16
    1.2.3 大肠杆菌AcrAB-TolC外输泵引起不同类药物的作用机制  16-17
    1.2.4 AcrAB-TolC系统的调节因子的调控机制  17-20
  1.3 应对主动外排的策略  20-21
    1.3.1 对现有抗生素药物进行修饰绕开外排系统  20
    1.3.2 微生物外排泵抑制剂的开发  20
    1.3.3 阻断外排能量来源的抑制剂  20
    1.3.4 竞争性外排蛋白抑制剂  20-21
    1.3.5 干扰外排泵组装的抑制剂  21
    1.3.6 从具有治疗活性的药物中筛选  21
  1.4 Red同源重组技术研究进展  21-25
    1.4.1 Red重组系统的结构及其重组机制  21-23
    1.4.2 Red重组系统的应用与前景展望  23-25
  1.5 耐药基因检测及基因表达差异  25-27
    1.5.1 耐药基因的检测方法  25
    1.5.2 耐药基因的mRNA表达差异  25
    1.5.3 Real-Time PCR的原理  25-27
第一章鸭大肠杆菌AcrB基因缺失株的构建  27-43
  引言  27
  1 材料  27-29
    1.1 菌株与质粒  27-28
    1.2 培养基和主要试剂  28
    1.3 药品  28
    1.4 主要仪器  28-29
  2 方法  29-35
    2.1 培养基和药液的配置  29-30
      2.1.1 SOB及SOC液体培养基的配制  29
      2.1.2 LB/Amp/X-gal/IPTG平板  29
      2.1.3 药液的制备  29-30
    2.2 PCR引物的设计  30
    2.3 质粒的提取  30-31
    2.4 融合PCR产物的制备和纯化  31-33
      2.4.1 短同源臂打靶DNA片段的制备  31-32
      2.4.2 长同源臂打靶DNA片段的制备  32-33
    2.5 感受态细胞的制备和Red重组功能的诱导  33-35
      2.5.1 CaCl_2法制备大肠杆菌O73(CVCC1547)感受态细胞  33
      2.5.2 质粒pKD46的转化  33
      2.5.3 O73/pKD46的验证  33-34
      2.5.4 O73/pKD46感受态细胞的制备  34
      2.5.5 打靶DNA片段的电击转化  34
      2.5.6 同源重组菌O73△acrB的PCR鉴定  34-35
  3 结果与分析  35-40
    3.1 pKD46、pKD4质粒的验证  35
    3.2 质粒pKD46的转化入大肠杆菌O73感受态细胞  35
    3.3 短同源臂融合PCR产物的制备  35-36
    3.4 融合PCR产物电转化至O73/pKD46  36-37
    3.5 长同源臂DNA片段的制备  37-40
      3.5.1 上、中、下三个片段的扩增与验证  37-38
      3.5.2 上、中、下三段基因片段的连接与验证  38-39
      3.5.3 长同源臂PCR产物的电击转化  39-40
    3.6 acrB基因敲除前后的鸭源大肠杆菌对抗生素的敏感性测定  40
  4 讨论  40-42
    4.1 基因敲除  40-41
    4.2 长同源臂和短同源臂的转化效率差异  41
    4.3 Red同源重组技术的注意事项  41-42
  5 小结  42-43
第二章 acrB基因敲除前后的O73及其不同药物诱导菌株相关基因的mRNA的表达水平测定  43-56
  引言  43
  1 材料与方法  43-47
    1.1 材料  43
      1.1.1 菌株、药物  43
      1.1.2 试剂  43
      1.1.3 仪器  43
    1.2 方法  43-47
      1.2.1 药物的配制  43-44
      1.2.2 细菌菌液的制备  44
      1.2.3 耐药菌的诱导  44
      1.2.4 相关调节基因、外排系统基因的mRNA表达水平  44-47
  2 结果与分析  47-54
    2.1 诱导后的菌株药物敏感性测定  47-48
    2.2 主动外排基因和调控基因mRNA的表达水平  48-54
      2.2.1 各个引物Real Time SYBR Green PCR融解曲线  48-50
      2.2.2 各个基因荧光定量PCR扩增曲线  50-52
      2.2.3 主动外排基因和其调控基因的mRNA表达水平  52-54
  3 讨论  54-55
    3.1 荧光定量PCR方法及其应用  54
    3.2 各主动外排基因的外排底物  54-55
  4 小结  55-56
本文创新点  56-57
英文摘要  57-59
附录英文缩略词表  59-60
参考文献  60-67

鸭大肠杆菌acrB基因的缺失突变株构建及其相关功能研究

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