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痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物的分离鉴定

作　者: 龚益熊
导　师: 吴兰；廖翔
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 痢疾杆菌膜复合物 BN-PAGE 腺苷三磷酸双磷酸酶亲和纯化 Red重组系统
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

痢疾杆菌是一种革兰氏阴性病原菌,通过各种分泌系统将毒力蛋白分泌到外部环境或者直接注入宿主细胞。迄今已经发现Ⅰ型到Ⅵ型共六种类型分泌系统,都是由单个蛋白或者大分子复合物形成一个跨越细菌细胞膜的通道。由于膜蛋白复合物结构复杂、疏水性强,难以从疏水的细胞膜脂双层中完整地分离纯化,因此长期以来对其研究局限于将可能的结构蛋白一个个单独进行结构和功能研究,缺乏整体性。近年来由Shaegger等人建立并逐渐成熟的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue Native PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,BN PAGE)为复合物研究带来新的突破。在痢疾杆菌的致病过程中,毒力大质粒编码许多侵袭相关蛋白比如Ⅲ型分泌系统复合物及其分泌的毒力因子,它的缺失会导致痢疾杆菌毒性的丧失。其细胞膜上除Ⅲ型分泌系统复合物之外,不仅还有5种类型分泌系统复合物未被分离鉴定,还可能有其它一些完全未知的复合物。本研究通过蓝色非变性凝胶电泳(BN PAGE)比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90T△T的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量约为290kDa,命名为M90T-290。通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为：一个由大质粒编码的毒力蛋白apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5个染色体编码的蛋白,分别为ClpB、DnaK、hypothetical protein S1768、translation elongation factor Tu、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas。M90T-290这个复合物是通过染色体和毒力大质粒的共同调控来实现M90T的致病性。鉴定出复合物的组成蛋白后,决定用标签亲和纯化技术对复合物的组成进行了验证。将apyrase的编码基因phoN2插入表达GST标签的PGEX 6p-1载体,构建成功apyrase-GST融合表达载体,转入M90T中,命名为M90T-6p-apy;制备该转化菌的膜蛋白复合物样品,用谷胱甘肽转移酶亲和柱纯化含GST标签的蛋白,利用BN PAGE分离纯化产物。结果没有分离得到GST-apyrase融合蛋白参与形成的复合物。分析可能是GST标签本身分子量比较大,改变了apyrase的三维结构导致无法形成复合物。于是将apyrase的编码基因phoN2插入到更小的表达His标签的PET 32a载体中,构建成功apryase-His融合表达载体,转入BL21中,命名为BL-PET-apyrase。诱导表达后超声破碎裂解细菌收集上清,发现在上清中有融合蛋白。然后利用镍柱进行亲和纯化,纯化得到apyrase-His融合蛋白。本实验构建的融合载体和纯化的融合蛋白为以后的复合物的验证奠定基础。同时为了对apyrase与M90T-290复合物的功能进行初步探索,利用Red重组系统敲除M90T中apyrase的编码基因phoN2。成功构建了线性打靶片段。把线性打靶片段转入含重组酶系统的PKOBEG感受态细胞中,通过卡纳霉素抗性标记筛选发生重组的缺失突变株。可能是由于重组效率低,目前还在筛选发生有效重组的缺失突变株。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第1章绪论  10-19
  1.1 志贺氏菌属的概述  10
  1.2 志贺氏菌属与大肠杆菌的进化关系  10-11
  1.3 志贺氏菌感染细胞的过程  11-12
  1.4 志贺氏菌疫苗的研究进展  12-14
    1.4.1 灭活的完整病原体  12
    1.4.2 减毒活疫苗  12-13
    1.4.3 亚单位疫苗  13-14
  1.5 膜蛋白的治疗靶点的研究进展  14-15
  1.6 研究膜蛋白的几种双向电泳技术的比较  15-16
  1.7 本课题的研究意义及研究现状  16-17
  1.8 本研究的目的和技术路线  17-19
第2章利用BN-PAGE/SDS-PAGE分离和鉴定志贺氏菌5a M90T毒力相关膜复合物  19-28
  2.1 材料与方法  19-24
    2.1.1 材料  19-21
    2.1.2 方法  21-24
  2.2 结果  24-26
    2.2.1 样品的制备  24
    2.2.2 BN-PAGE分离膜复合物  24-25
    2.2.3 SDS PAGE分离M90T-290膜复合物和质谱检测结果  25-26
  2.3 讨论  26-28
第3章利用GST标签亲和纯化技术验证M90T-290复合物的亚基组成  28-39
  3.1 材料与方法  28-33
    3.1.1 材料  28-30
    3.1.2 方法  30-33
  3.2 结果  33-38
    3.2.1 基因phoN2片段的扩增  33-34
    3.2.2 DH-PGEX-apy的菌落PCR鉴定  34-35
    3.2.3 M90T-PGEX-apy的菌落PCR鉴定结果  35
    3.2.4 BN-PAGE电泳分离GST磁珠结合M90T-PGEX-apy诱导菌膜复合物  35-36
    3.2.5 利用Western blot检验GST-apyrase融合蛋白  36-37
    3.2.6 利用SDS-PAGE分离M90T-PGEX-apy诱导菌蛋白  37-38
  3.3 讨论  38-39
第4章 M90T膜蛋白apyrase的基因克隆、原核表达及纯化  39-48
  4.1 材料与方法  39-42
    4.1.1 材料  39-41
    4.1.2 方法  41-42
  4.2 结果  42-46
    4.2.1 phoN2基因片段的扩增  42-43
    4.2.2 DH-PET-apy菌落PCR鉴定  43
    4.2.3 利用SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白在BL-PET-apy中的表达量  43-44
    4.2.4 纯化His-apyrase和Western blot检测纯化产物  44-46
  4.3 讨论  46-48
第5章福氏5a M90T的phoN2基因缺失突变体的构建  48-55
  5.1 材料与方法  49-52
    5.1.1 材料  49-50
    5.1.2 方法  50-52
  5.2 结果  52-54
    5.2.1 phoN2上下游伺源臂的扩增  52
    5.2.2 phoN2上游同源臂菌落PCR鉴定  52-53
    5.2.3 phoN2上下游同源臂菌落PCR鉴定  53
    5.2.4 将打靶片段电转入PKOBEG菌感受态  53-54
  5.3 讨论  54-55
第6章结论与展望  55-57
  6.1 结论  55-56
  6.2 展望  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-62
攻读学位期间的研究成果  62

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