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痤疮丙酸杆菌中脂肪酶基因的原核表达及其应用

作　者: 闫斯楠
导　师: 于源华
学　校: 长春理工大学
专　业: 无机化学
关键词: 痤疮丙酸杆菌脂肪酶克隆表达酶活力降解作用
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

本文实现了痤疮丙酸杆菌脂肪酶的基因克隆表达,并对重组酶的酶学性质和降解作用进行研究。从痤疮丙酸杆菌基因组中克隆脂肪酶基因(liphy),与pUCm-T载体连接,构建克隆载体pUCm-T-liphy。测序正确后,将liphy亚克隆至表达载体pET-15b连接,构建充足表达质粒pET-15b-liphy,转化到宿主菌BL21(DE3)PlysS后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为37kDa的特异性条带,但较多部分以包涵体形式存在。优化表达条件,确定最优条件为：pH6.0,30℃培养,转接量1：60,IPTG终浓度0.4mM,诱导24h。采用Ni柱对表达产物进行纯化,SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度达到95%以上,纯化回收率为37.25%。酶学性质研究表明,该酶反应的比活力为91.43U/ml,最适pH为9.5；最适温度为30。C；具有一定的热稳定性。此外,Mg2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,而CO2+、 Fe3+、Cu2+、Zn2+、Tween20、Tween80、Triton-100、SDS及EDTA-Na2则不同程度抑制酶活。以棕榈酸对硝基苯酯作为底物测定重组脂肪酶的Km值为36.084uM。检测该酶对SKOV3卵巢癌细胞和人二倍体细胞的毒理性,发现IC50分别为150μg/mL和300μg/mL。利用该酶进行降解实验,经检测发现对橄榄油、地沟油等具有降解作用,为脂肪酶在洗涤工业、环境治理等方面的应用奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章绪论  9-16
  1.1 脂肪酶概述  9-12
    1.1.1 脂肪酶的概念  9
    1.1.2 脂肪酶的来源  9-10
    1.1.3 痤疮丙酸杆菌脂肪酶  10-12
  1.2 脂肪酶的酶学性质及应用  12-13
    1.2.1 脂肪酶的酶学性质  12
    1.2.2 脂肪酶的应用  12-13
  1.3 脂肪酶的国内外研究进展  13-14
    1.3.1 国外研究进展  13
    1.3.2 国内研究进展  13-14
  1.4 研究意义与目的  14
  1.5 研究内容  14-16
    1.5.1 主要研究内容  14-15
    1.5.2 创新点  15-16
第二章脂肪酶基因的克隆及克隆载体的构建  16-31
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 仪器及药品  16
    2.1.2 质粒及菌株  16
    2.1.3 试剂及培养基  16-17
  2.2 实验内容  17-21
    2.2.1 引物的设计与合成  17
    2.2.2 liphy基因的PCR扩增与鉴定  17-18
    2.2.3 克隆载体pUCm-T-liphy的构建  18-21
  2.3 实验结果  21-29
    2.3.1 目的片段的PCR扩增  21-22
    2.3.2 克隆载体pUCm-T-liphy的鉴定  22-29
  2.4 结果讨论  29-30
    2.4.1 脂肪酶基因的克隆  29
    2.4.2 克隆载体pUCm-T-liphy的构建及测序  29-30
  2.5 小结  30-31
第三章重组表达载体pET-15b-liphy的构建及重组酶表达  31-43
  3.1 实验材料  31-33
    3.1.1 仪器及药品  31
    3.1.2 质粒及菌株  31
    3.1.3 试剂及培养基  31-33
  3.2 实验内容  33-37
    3.2.1 重组表达载体pET-15b-liphy的构建  33
    3.2.2 重组表达载体pET-15b-liphy的转化及鉴定  33-34
    3.2.3 诱导表达重组脂肪酶  34-37
  3.3 实验结果  37-40
    3.3.1 liphy基因片段和pET-15b载体的双酶切回收鉴定  37
    3.3.2 重组表达载体pET-15b-liphy的鉴定  37-40
    3.3.3 重组脂肪酶诱导表达  40
  3.4 结果讨论  40-41
    3.4.1 重组载体pET-15b-liphy的构建  40-41
    3.4.2 诱导表达重组脂肪酶  41
  3.5 小结  41-43
第四章重组脂肪酶表达条件的优化及纯化  43-55
  4.1 实验材料  43-45
    4.1.1 仪器及药品  43
    4.1.2 菌种及质粒  43
    4.1.3 培养基及试剂  43-45
  4.2 实验内容  45-48
    4.2.1 控制变量法优化重组脂肪酶表达条件  45-46
    4.2.2 正交法优化重组脂肪酶表达条件  46-47
    4.2.3 重组脂肪酶的分离纯化  47-48
  4.3 实验结果  48-53
    4.3.1 控制变量法优化重组脂肪酶表达条件  48-51
    4.3.2 正交法优化重组脂肪酶表达条件  51-53
    4.3.3 重组脂肪酶的分离纯化  53
  4.4 结果讨论  53-54
    4.4.1 影响原核表达的因素  53-54
    4.4.2 重组脂肪酶的分离纯化  54
  4.5 小结  54-55
第五章重组脂肪酶的酶学性质及应用  55-69
  5.1 实验材料  55-56
    5.1.1 仪器及药品  55
    5.1.2 菌种及质粒  55
    5.1.3 培养基及试剂  55-56
  5.2 实验内容  56-59
    5.2.1 重组脂肪酶的酶学性质  56-58
    5.2.2 重组脂肪酶的MTT毒性试验  58
    5.2.3 重组脂肪酶对地沟油及橄榄油的降解作用  58-59
  5.3 实验结果  59-67
    5.3.1 重组脂肪酶的酶学性质  59-64
    5.3.2 重组脂肪酶的MTT毒性试验  64-65
    5.3.3 重组脂肪酶对地沟油及橄榄油的降解作用  65-67
  5.4 结果讨论  67-68
    5.4.1 重组脂肪酶的酶学性质  67
    5.4.2 重组脂肪酶的MTT毒性试验  67-68
    5.4.3 重组脂肪酶对地沟油及橄榄油的降解作用  68
  5.5 小结  68-69
结论  69-70
致谢  70-71
参考文献  71-72

痤疮丙酸杆菌中脂肪酶基因的原核表达及其应用

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