学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

苹果Flowering locus T (FT)基因及其启动子的克隆及表达分析

作　者: 郑小一
导　师: 章镇；王三红
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果 FT基因启动子克隆表达
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 22次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

开花是植物生命周期的一个重要组成部分,也是果树发育的重要过程。苹果作为多年生木本植物,童期较长,育成一个品种要耗费10～20年,因此研究苹果开花的分子机理,对果树育种及其遗传研究都具有重要的意义。一方面,缩短童期可以加速果树的遗传改良和试验研究进程。另一方面,可以实现果树的早实丰产。Following locus T(FT)基因在拟南芥和瓜类等植物中被证明为“成花素”类物质,决定着开花时间,可激活花分生组织特征基因,诱导植物开花。对果树FT同源基因表达调控规律及其功能的研究,有利于了解果树成花和阶段转变的分子机理,为进一步利用基因工程改良品种提供依据。1,苹果FT基因的克隆与表达分析为探明苹果FT同源基因的功能和表达规律,本研究以‘富士’苹果为材料,获得了长为598 bp的FT基因的cDNA序列,命名为AdFT3(GenBank登录号：GQ465756)。经PCR克隆和序列分析验证,结果表明,该cDNA序列具有完整的开放阅读框(ORF),推测编码174个氨基酸。其氨基酸序列与苹果MdFT2 (FJ555224).苹果MdFTL(AB161112)、桃PpFT(EU939302)、杨树PdFTL1 (AY515152)和葡萄VvFT(EF157728)的FT/FTL同源性分别为99.4%、93.7%、96.6%、87.4%和89.1%。进化分析表明,MdFT3属于PEBP家族中的FT亚家族,与桃PpFT和果梅PmFT亲缘关系最近,与黑杨PnFT.柑橘CiFT和枳CTRSFTL1等亲缘关系较远。采用半定量RT-PCR分析MdFT3基因在苹果种子、幼果、不同时期的叶片、以及花的不同时期、不同器官和组织中的表达水平,结果表明：MdFT3基因在种子、幼果、叶以及花中均有表达。在叶片中,MdFT3基因的表达随叶片发育呈下降趋势,叶芽中的表达量较高。在种子中MdFT3基因表达量较低。在花器官中,随着花器官的发育,MdFT3基因的表达整体呈下降趋势,以小蕾期的表达量最高。花器官中,花药和子房的表达量高于花瓣、花萼和花丝。2,苹果FT基因启动子的克隆及序列分析启动子作为转录水平上的一种重要调控元件,严格调控植物基因表达。本实验应用PCR技术从‘富士’苹果中克隆了1条长为1620 bp的基因组DNA序列,该序列含有3个内含子和4个外显子,编码174个氨基酸,与苹果FT同源基因有99%的同源性。采用基因组步移法克隆了FT基因的5’侧翼序列1784 bp,拼接后的苹果FT基因及启动子序列共3250 bp,命名为MdFT-P(GenBank登录号GQ148775)。用PLACE.PlantCARE在线启动子预测工具分析表明：该序列含有5UTR Pyrich stretch序列和启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box等保证转录的精确起始和转录频率。另外含有一些顺式作用元件如ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif、光响应元件和一些其他的调控序列,由此推测苹果MdFT-P基因的表达可能受ABA、GA、MeJA和光等因素的调控。3,苹果FT启动子连接GUS基因植物表达载体的构建及GUS因的瞬时表达分析为了进一步研究并验证苹果FT基因启动子的功能和表达调控规律,根据已经克隆的MdFT-P基因启动子序列(GenBank登录号GQ148775),及其MdFT-P基因5’上游启动子序列不同元件的分布情况,设计5条PCR引物,并在其5’端分别引入相应的酶切位点,扩增MdFT-P基因5’上游启动子的不同区段(-1～-167；-1～-300；-1～-787；-1～-1102；-1～-1585),将扩增产物酶切后连接植物表达载体pYH4215,替代pYH4215载体35S：：GUS的35S启动子,构建MdFT-P基因启动子不同区段连接GUS基因的植物表达载体。将MdFT-P基因不同长度启动子连接GUS基因的植物表达载体,采用农杆菌介导法转化到烟草叶片中,经GUS组织化学瞬时染色,结果表明5个缺失片段均具有启动子活性,随着启动子区域的扩大转录活性升高。通过研究MdFT-P基因缺失启动子区域的活性并确定转录调控的结构域,对深入研究FT基因转录调控机制提供了指导。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-11缩略词 11-12前言 12-14第一章文献综述 14-26 1 花器官的形成过程 14-17 1.1 成花诱导 14-17 1.1.1 光周期诱导途径 14-15 1.1.2 春化作用途径 15-16 1.1.3 自主途径 16 1.1.4 赤霉素(GA)诱导途径 16-17 1.2 花的发端 17 1.3 花器官的发育 17 2 FT及其同源基因 17-23 2.1 FT基因的起源——开花素学说 17-18 2.2 开花过程的相关基因及其功能 18-21 2.3 FT基因的研究进展 21-23 3 半定量RT-PCR技术 23-24 4 基于PCR的染色体步移技术 24-26第二章苹果FT基因的克隆与表达分析 26-38 1 材料 27 1.1 植物材料 27 1.2 菌种及试剂 27 2 方法 27-31 2.1 苹果FT基因的克隆 27-30 2.1.1 总RNA的提取 27-28 2.1.2 基因组DNA的消化 28 2.1.3 cDNA第一链的合成 28 2.1.4 苹果FT基因编码区的扩增 28-29 2.1.5 PCR产物的回收 29 2.1.6 目的片段的连接,转化及测序 29-30 2.1.7 FT基因3'RACE扩增 30 2.2 生物信息学分析 30 2.3 苹果FT基因的半定量RT-PCR分析 30-31 2.3.1 不同组织RNA的提取及消化 30 2.3.2 cDNA第一链的合成 30-31 2.3.3 RT-PCR分析 31 3 结果与分析 31-36 3.1 总RNA提取 31-32 3.2 苹果FT基因cDNA序列的获得 32 3.3 氨基酸序列分析 32-35 3.4 MdFT3基因在苹果不同器官中的时空表达分析 35-36 4 讨论 36-38第三章苹果FT基因启动子的克隆及序列分析 38-52 1 材料 38-39 1.1 植物材料 38 1.2 主要试剂 38-39 2 方法 39-43 2.1 基因组DNA的提取 39 2.2 DNA质量检测方法 39 2.3 FT基因组DNA的克隆 39-40 2.4 FT基因上游调控序列的克隆 40-43 2.4.1 接头、引物设计与合成 41-42 2.4.2 基因组步移文库构建 42 2.4.3 PCR反应 42-43 2.5 启动子序列分析 43 3 结果与分析 43-48 3.1 FT基因组DNA序列的克隆 43 3.2 FT基因上游调控序列的克隆与分析 43-48 3.2.1 基因组DNA的酶切、接头连接 43-44 3.2.2 Touch-Down PCR 44 3.2.3 序列分析及顺式元件预测 44-48 4 讨论 48-52第四章苹果FT启动子不同区段表达载体构建及GUS基因的瞬时表达分析 52-62 1 材料 53 1.1 植物材料 53 1.2 菌株和质粒 53 1.3 分子生物学试剂 53 2 方法 53-57 2.1 烟草无菌苗的获得 53 2.2 FT基因启动子不同区段连接GUS基因的植物表达载体的构建 53-56 2.3 农杆菌介导的烟草叶片转化 56-57 2.3.1 将载体质粒转入农杆菌 56-57 2.3.2 农杆菌菌株的活化 57 2.3.3 烟草叶盘法遗传转化 57 2.4 GUS基因表达的组织化学检测 57 3 结果与分析 57-60 3.1 FT基因启动子不同区段连接GUS基因的植物表达载体的构建 58-59 3.2 农杆菌介导烟草叶片GUS基因的组织化学检测 59-60 4 讨论 60-62全文结论 62-64创新之处 64-66参考文献 66-74附录 74-80 附录1 本论文中常用试剂及培养基的配置 75-77 附录2 本论文中所用的DH5α感受态CCMB80的制备 77-79 附录3 根癌农杆菌感受态细胞的制备 79-80硕士在读期间发表的论文 80-82致谢 82

苹果Flowering locus T (FT)基因及其启动子的克隆及表达分析

内容摘要

全文目录

相似论文