学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

呼吸道合胞病毒融合蛋白G_（CTL）-Ag85B免疫原性研究

作　者: 卜选运
导　师: 井申荣
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道合胞病毒 GCTL-Ag85B Ag85B GCTL LT 免疫原性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 4次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是婴儿、免疫低下者和老人下呼吸道感染的主要病原体,目前仍然没有安全有效的RSV疫苗上市。本实验将GCTL基因(RSV G蛋白基因130-230片段,其中用CTL表位替换了CX　C模序)与AgB5B基因(结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B基因)融合表达并辅以黏膜佐剂后免疫昆明种小鼠,来分析和评价蛋白的免疫原性。PCR获得GCTL和Ag85B基因,构建表达载体GCTL-Ag85B-pET30a、Ag85B-pET28a,将这两个载体与已经设计好的载体GCTL-pET22b分别转入大肠杆菌BL21中表达。应用His-Tag与Ni离子的亲和力对GCTL-Ag85B、Ag85B蛋白进行纯化,通过透析复性可直接得到纯化的GCTL。将纯化后的GCTL-Ag85B、Ag85B、GCTL三个蛋白分别与无毒型大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labil enterotoxin, LT)混合后免疫昆明种小鼠,免疫共设5组,分别是：GCTL-Ag85B+LT、Ag85B+LT、GCTL+LT、LT、PBS,免疫在0、2、4周进行。免疫结束以后,针对血清IgG、IgA、IgG2aIgG1、呼吸道sIgA用ELISA进行测定,对血液和肺灌洗液中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞进行计数。用106pfu/ml RSV滴鼻攻毒免疫后的小鼠,连续3天。攻毒结束后处死小鼠,再次针对血清IgG、IgA、IgG2aIgG1、呼吸道sIgA用ELISA进行测定并对血液和肺灌洗液中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数。GCTL-Ag85B、Ag85B、GCTL在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,在37℃下诱导4h表达分别占到总蛋白的20%、40%、30%以上,Western Blotting结果证明所表达的是目的蛋白GCTL-Ag85B、GCTL、Ag85B蛋白。利用His-Tag与Ni离子的亲和力纯化后GCTL-Ag85B、Ag85B蛋白纯度达到90%,GCTL直接透析复性纯化以后纯度达92%。免疫检测结果表明：血清IgG在第二、三次免疫后,GCTL-Ag85B+LT、GCTL+LT组抗体滴度高于Ag85B+LT、LT、PBS组(P<0.05);对于第三次免疫后血清IgA和免疫后肺灌洗液中的slgA GCTL-Ag85B+LT、GCTL+LT组抗体滴度高于Ag85B+LT、LT、PBS组(P<0.05)；在免疫后测血清IgGl/IgG2a,结果证明GCTL-Ag85+LT组相对于GCTL+LT、Ag85B+LT组的免疫极化趋于平衡；同时LT也有平衡Th1/Th2调节免疫极化的作用；免疫后蛋白组的小鼠血液和肺部灌洗液中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的量比P13S高(P<0.05)。攻毒检测结果表明：攻毒以后GCTL-Ag85B+LT、GCTL+LT组IgG滴度高于Ag85B+LT、LT、PBS组(P<0.05); IgG2aIgGl在免疫后和功毒后没有什么差别；血清IgA和sIgA在攻毒后GCTL-Ag85B+LT、GCTL+LT组抗体滴度高于Ag85B+LT、LT、PBS组(P<0.05)；攻毒后GCTL-Ag85B+LT组嗜酸性粒细胞数量和嗜碱性粒细胞数量低于Ag85B+LT组(P<0.05)同时又高于GCTL+LT组(P<0.05).本实验成功构建了表达载体GCTL-Ag85B-pET30a、Ag85B-pET28a,并表达纯化了这两个蛋白和GCTT.蛋白,并测定了各蛋白的免疫原性。实验结果显示,混以LT佐剂后提高了机体黏膜分泌sIgA的量,GCTL-Ag85B相对于GCTL和Ag85B的极化趋于平衡,GCTL-Ag85B相对于Ag85B可以降低攻毒后嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数目,从而减少炎症反应,攻毒实验还证明GCTL-Ag85B具有免疫原性。呼吸道合胞病毒融合蛋白GCTL-Ag85B的免疫原性研究为RSV疫苗研发奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
插图和附表清单  11-13
缩略语索引  13-14
第一章文献综述  14-19
  1.1 呼吸道合胞病毒  14
  1.2 呼吸道合胞病毒特征  14-15
  1.3 呼吸道合胞病毒蛋白简介  15
  1.4 目前RSV疫苗的研究进展  15-19
    1.4.1 RSV疫苗研究所面临的问题  16
    1.4.2 RSV亚单位疫苗  16-18
    1.4.3 结语  18-19
第二章前言  19-21
第三章表达载体G_(CTL)-Ag85B-pET30a的构建  21-40
  3.1 材料和方法  21-33
    3.1.1 材料  21-24
    3.1.2 方法  24-33
  3.2 结果  33-38
    3.2.1 PCR扩增G_(CTL)、Ag85B1、Ag85B2基因片段  33-34
    3.2.2 重组质粒G_(CTL)-pMD18-T、Ag85B1-PCR2.1、Ag85B2-pMD18-T的酶切鉴定  34-35
    3.2.3 重组质粒G_(CTL)-pET30a、G_(CTL)-Ag85B2-pET30a、Ag85B1-pET28a的酶切鉴定  35-36
    3.2.4 重组质粒G_(CTL)-Ag85B2-pET30a、Ag85B1-pET28a的测序鉴定  36-38
  3.3 讨论  38-39
    3.3.1 引物设计  38-39
    3.3.2 载体的选用  39
  3.4 小结  39-40
第四章目的蛋白G_(CTL)-Ag85B1-pET28a的表达与纯化  40-55
  4.1 材料和方法  40-49
    4.1.1 材料  40-45
    4.1.2 方法  45-49
  4.2 结果  49-53
    4.2.1 目的蛋白的表达  49-51
    4.2.2 Western Blotting鉴定蛋白  51
    4.2.3 目的蛋白的纯化结果  51-53
  4.3 讨论  53-54
    4.3.1 蛋白的表达与纯化  53
    4.3.2 蛋白纯化方式的选择  53-54
    4.3.3 蛋白的鉴定  54
  4.4 小结  54-55
第五章融合蛋白G_(CTL)-Ag85B免疫原性测定  55-78
  5.1 材料和方法  55-62
    5.1.1 材料  55-57
    5.1.2 方法  57-61
    5.1.3 数据统计  61-62
  5.2 结果  62-74
    5.2.1 考马斯亮蓝标准曲线  62
    5.2.2 小鼠第一次、第二次、第三次免疫血清中IgG的量  62-63
    5.2.3 小鼠免疫后血液和肺灌洗液中嗜碱性粒细胞计数  63-64
    5.2.4 小鼠免疫后血液和肺灌洗液中嗜酸性粒细胞计数  64-66
    5.2.5 小鼠血清中G_(CTL)蛋白特异性抗体IgA的检测  66
    5.2.6 小鼠肺灌洗液中G_(CTL)蛋白特异性抗体sIgA的检测  66-67
    5.2.7 免疫后小鼠血清中G_(CTL)蛋白特异性IgG1/IgG2a结果  67-68
    5.2.8 攻毒以后小鼠体重变化结果  68-69
    5.2.9 攻毒以后小鼠血清中IgG  69
    5.2.10 攻毒以后小鼠血清中IgA  69-70
    5.2.11 攻毒以后小鼠肺灌洗液中sIgA  70-71
    5.2.12 攻毒以后小鼠血清IgG1/IgG2a  71
    5.2.13 攻毒以后小鼠血液和肺灌洗液中嗜碱性粒细胞的量  71-73
    5.2.14 攻毒以后小鼠血液和肺灌洗液中嗜酸性粒细胞的量  73-74
  5.3 讨论  74-77
    5.3.1 LT佐剂的选用  74
    5.3.2 免疫指标的检测  74-75
    5.3.3 攻毒后小鼠体重变化  75-76
    5.3.4 嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞数量的差异  76-77
  5.4 小结  77-78
第六章全文总结  78-79
第七章展望  79-80
致谢  80-81
参考文献  81-84
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  84

呼吸道合胞病毒融合蛋白G_（CTL）-Ag85B免疫原性研究

内容摘要

全文目录

相似论文