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N-糖基化对乙型脑炎病毒感染与免疫保护特性的研究

作　者: 张子重
导　师: 陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 乙型脑炎病毒 N-糖基化感染增殖免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是一种危害严重的人兽共患虫媒传染病,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一。其病原体是乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),该病毒不仅侵害人的神经系统,导致人的死亡,而且还可以引起种猪的繁殖性障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。N-糖基化对乙型脑炎病毒的作用还不清楚,开展乙型脑炎病毒的N-糖基化的研究,对于揭示N-糖蛋白对该病毒感染与增殖的影响,以及去N-糖基化DNA疫苗的免疫效果具有重要科学和实践意义。本课题研究去N-糖基化修饰对乙型脑炎病毒感染和增殖的作用,还通过一系列除去N-糖基化的突变体prME和NS1蛋白免疫小白鼠,初步了解N-糖基化对免疫的重要作用。1.N-糖基化对JEV感染和增殖作用的研究用糖苷内切酶PNGase F和Endo H处理乙型脑炎病毒,以切去乙型脑炎病毒表面的N-糖链,将酶切后的乙型脑炎病毒进行Western blot试验以观察去糖基化情况,同时将糖工酶处理的JEV接种BHK-21细胞进行蚀斑试验,观察蚀斑的大小及病毒滴度的变化情况,以研究N-糖基化在病毒侵染过程中的作用。同时用衣霉素处理BHK-21细胞并同步接种乙型脑炎病毒,进行蚀斑试验,观察蚀斑大小的变化与病毒增殖情况,以研究N-糖基化在病毒增殖过程中的作用。结果显示,由Endo H和PNGase F处理的乙型脑炎病毒形成的蚀斑均显著小于未经处理的病毒对照,病毒增殖滴度显著降低。衣霉素处理细胞后,病毒产生的蚀斑大小没有明显差异,但增殖滴度显著降低。通过本研究说明,N-糖链对乙型脑炎病毒感染与增殖过程中均具有重要作用,切除乙型脑炎病毒表面的N-糖链后,乙型脑炎病毒感染能力与增殖能力显著下降。2.N-糖基化对JEV基因免疫效果的研究用N-糖基化预测软件,对乙型脑炎病毒的prME和NS1蛋白的基因序列进行分析,预测出其各有两个潜在的N-糖基化位点,设计定点突变引物,参考点突变试剂盒的原理,利用PCR方法进行定点突变,消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的N-糖基化位点,测序鉴定正确后,构建prME和NS1基因突变的真核表达质粒,分别为prM的第15个氨基酸位点突变的mcprME15, E的第154个氨基酸位点突变的mcprME154, prM的第15个氨基酸位点和E的第154个氨基酸位点双突变的mcprME15154,NS1的第130个氨基酸位点突变的mc NS1130, NS1的第207个氨基酸位点突变的mc NS1207, NS1的第130和207两个氨基酸位点双突变的mcNS1130207,以及未突变的pcprME和pcNS1。对照组包括真核表达载体pcDNA3.1对照、乙型脑炎病毒SA14-14-2弱毒疫苗对照和空白对照。将上述质粒以5μg/只剂量免疫四周龄雌性小白鼠,于首免后两周加强免疫一次,一免后两周和二免后两周采集小鼠血液,血清进行ELISA抗体检测与中和抗体的检测,于二免后两周对小鼠进行攻毒,做免疫保护力统计。结果显示,乙型脑炎病毒prME蛋白及其消除N-糖基化位点的蛋白免疫小白鼠,均能诱导小鼠产生ELISA抗体、中和抗体和免疫保护力,消除单个N-糖基化的mcprME15和mcprME154与未消除糖基化pcprME刺激小鼠产生的抗体、中和抗体以及免疫保护力大体相同,消除两个N-糖基化位点的prME蛋白诱导小鼠产生的抗体、中和抗体和免疫保护力低于未突变蛋白；NS1蛋白及其消除N-糖基化位点蛋白的能诱导小鼠产生较好的免疫保护力,消除单个N-糖基化位点的NS1蛋白诱导小鼠产生的保护率高达到100%高于未突变蛋白免疫组的80%。消除两个N-糖基化位点的NS1蛋白诱导小鼠产生的免疫保护率为75%稍低于未突变蛋白免疫组。由此得出消除蛋白的单个N-糖基化位点能增强乙型脑炎蛋白的免疫原性,消除两个N-糖基化位点则降低病毒的免疫原性。通过本研究结果说明乙型脑炎病毒的prME蛋白和NS1蛋白的N-糖基化在免疫过程中起着重要的作用,消除了蛋白的N-糖基化,能改变它的免疫原性和免疫效果。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表(ABBREVIATION)  10-12
第1章文献综述  12-17
  1.1 JE的历史及其危害  12
  1.2 JE的病原学及流行病学特性  12-14
    1.2.1 JE病原学  12-13
    1.2.2 JEV PrM、E和NS1蛋白的功能  13
    1.2.3 JE流行特征  13-14
    1.2.4 JE传播媒介和宿主  14
  1.3 JE疫苗  14
  1.4 糖基化与黄病毒  14-17
    1.4.1 糖基化与病毒的研究  14-15
    1.4.2 糖基化对病毒免疫的影响  15-16
    1.4.3 黄病毒N-糖基化的研究  16
    1.4.4 N-糖基化与黄病毒蛋白免疫  16-17
第2章研究目的和意义  17-18
第3章材料与方法  18-32
  3.1 试验材料  18-22
    3.1.1 菌株、细胞和毒株  18
    3.1.2 载体与质粒  18-19
    3.1.3 主要仪器及设备  19-20
    3.1.4 酶、试剂和引物  20
    3.1.5 主要溶液的配制  20-22
    3.1.6 实验动物  22
  3.2 试验方法  22-32
    3.2.1 病毒的扩增  22
    3.2.2 蚀斑法测定乙型脑炎病毒滴度  22-23
    3.2.3 JEV去糖基化处理  23
    3.2.4 JEV去糖基化处理后Western blot验证  23-24
    3.2.5 JEV去糖基化处理后的蚀斑试验  24
    3.2.6 JEV滴度统计及蚀斑大小的测定  24
    3.2.7 JEV的RNA提取  24-25
    3.2.8 目的基因片段的获得及质粒的构建  25-27
    3.2.9 目的基因的定点突变及真核表达质粒的构建  27-30
    3.2.10 DNA免疫小白鼠试验  30
    3.2.11 ELISA检测免疫小白鼠血清抗体滴度  30
    3.2.12 免疫小白鼠的血清中和试验  30-31
    3.2.13 免疫小白鼠免疫保护力检测试验  31-32
第4章结果与分析  32-42
  4.1 N-糖基化对JEV感染和增殖作用的研究  32-35
    4.1.1 JEV的扩增滴度测定  32
    4.1.2 糖工酶处理JEV去糖基化后Western blot结果  32-33
    4.1.3 糖工酶处理JEV去糖基化后蚀斑试验  33-34
    4.1.4 JEV去糖基化后滴度变化统计  34-35
  4.2 N-糖基化对JEV基因免疫效果的研究  35-42
    4.2.1 JEV NS_1基因片段的获取  35-36
    4.2.2 PCR定点突变及真核表达质粒构建  36-38
    4.2.3 免疫小白鼠血清抗体滴度检测  38-39
    4.2.4 免疫小白鼠血清中和抗体的检测  39-40
    4.2.5 免疫小白鼠免疫保护力检测  40-42
第5章讨论与结论  42-45
  5.1 讨论  42-44
    5.1.1 N-糖基化对JEV感染和增殖的作用  42-44
    5.1.2 N-糖基化对JEV基因免疫效果的影响  44
  5.2 结论  44-45
参考文献  45-50
致谢  50

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