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草莓灰葡萄孢拮抗菌株的筛选、鉴定及其抗菌活性物质研究

作　者: 熊艳
导　师: 张宏；张晓喻
学　校: 四川师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鉴定 枯草芽孢杆菌 抗菌蛋白 纯化
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文以草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为靶标病原菌,采用稀释法,从农田土壤中分离得到一株对其有较强拮抗作用的菌株Loq18,经形态观察、生理生化及分子鉴定确定为一株枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)。Loq18菌株除菌发酵液具有抗菌活性,根据其对草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的毒力方程,得最小抑菌浓度(MIC)为20.48mg/mL。除菌发酵液经硫酸铵沉淀得具抗菌活性的粗蛋白,除蛋白后上清液不具抗菌活性,确定其抗菌活性物质主要为胞外分泌蛋白。为初步了解此抗菌粗蛋白的理化性质,分别研究了温度、pH变化、UV照射、有机溶剂和蛋白酶对其稳定性的影响。实验结果显示,该抗菌粗蛋白具有良好的热稳定性,121℃高压灭菌处理20min后仍具有对照活性的95%以上;对酸碱不敏感,pH值4~11范围内活性相对稳定;对紫外线稳定,在紫外光下照射10h以上时,其活性基本不受影响;经乙醚、丙酮等有机溶剂处理后仍具有对照活性的90%以上;对部分蛋白酶较稳定。抗菌粗蛋白经Sephadex G-75柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-25脱盐,纯化获得抗菌蛋白LP18。利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)、双缩脲反应和茚三酮反应、氨基酸组成分析、脂基和糖基检测对纯化蛋白进行鉴定。结果表明抗菌蛋白LP18是多亚基蛋白,亚基分子量为4283.7 Da,由Leu、Glu、Asp等14种氨基酸组成,含肽键及α-氨基酸,不含脂基和糖基。以实验室所保存的多种病原菌为靶标,检测抗菌蛋白LP18抗菌活性。结果表明,抗菌蛋白LP18对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、玉米弯胞病菌(Curvularia lunata)等多株植物病原真菌均有较强拮抗活性,具有防治多种植物真菌病害的应用前景。经抗菌蛋白LP18作用后的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)显微观察结果显示,其抗菌机理可能是通过溶解细胞壁及改变细胞膜透性导致原生质渗漏,从而使菌丝断裂或畸形,同时抑制孢子的萌发。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-8
第一章 前言  8-14
  1 灰霉病的发生及其防治  8-9
    1.1 灰霉病的发生概况  8
    1.2 灰霉病的防治  8-9
  2 灰霉病的生物防治  9-12
    2.1 生物防治的机理  9-10
    2.2 灰霉病的生防微生物  10-12
  3 本研究的目的和意义  12-13
  4 实验方案  13-14
第二章 拮抗菌株的分离筛选与鉴定  14-24
  1 材料、试剂与仪器  14
    1.1 材料  14
    1.2 主要试剂  14
    1.3 主要仪器  14
  2 方法  14-19
    2.1 拮抗菌株的分离和筛选  14-15
    2.2 拮抗细菌种类鉴定  15-18
    2.3 Loq18 菌株的分子鉴定  18-19
  3 结果与分析  19-23
    3.1 拮抗菌的分离和筛选  19-20
    3.2 Loq18 菌株的鉴定  20-21
    3.3 Loq18 16S rDNA 的序列分析  21-23
  4 讨论  23-24
第三章 拮抗菌株抗菌活性物质研究  24-46
  1 材料、试剂与仪器  24-25
    1.1 材料  24
    1.2 主要试剂  24
    1.3 主要仪器  24-25
  2 方法  25-32
    2.1 Loq18 菌株发酵时间与其发酵产物抗菌活性的关系  25-26
    2.2 Loq18 菌株发酵产物毒力方程测定  26
    2.3 Loq18 菌株抗菌活性成分稳定性测定  26-29
    2.4 Loq18 菌株抗菌蛋白的分离纯化  29-30
    2.5 抗菌蛋白 LP18 理化性质研究  30-31
    2.6 抗菌蛋白 LP18 抑菌谱的测定  31-32
    2.7 抗菌蛋白 LP18 抗菌机理的初步研究  32
  3 结果与分析  32-44
    3.1 Loq18 菌株培养时间与拮抗物质产生的关系  32-33
    3.2 Loq18 菌株发酵产物毒力方程  33-34
    3.3 最适硫酸铵饱和度的确定  34-35
    3.4 抗菌粗蛋白的稳定性  35-38
    3.5 抗菌蛋白的分离纯化  38-41
    3.6 抗菌蛋白 LP18 理化性质  41-42
    3.7 抗菌蛋白 LP18 抑菌谱  42-43
    3.8 抗菌蛋白抗菌机理研究  43-44
  4 讨论  44-46
参考文献  46-51
致谢  51-52
在校期间科研成果  52

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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